磷酸二酯酶抑制劑對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：以大鼠全腦缺血再灌注損傷為動物模型，觀察咯利普蘭（Rolipram）對腦組織病理學(xué)改變、學(xué)習(xí)記憶障礙的保護作用，并在此基礎(chǔ)上探討磷酸二酯酶4（PDE4）抑制劑的作用機制。對大鼠海馬組織PDE活性進行檢測并體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)祖細(xì)胞，觀察咯利普蘭對細(xì)胞增殖及分化的影響。 方法：（1）采用大鼠Pulsinelli四血管阻斷法制備全腦缺血模型，將大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、咯利普蘭0.3 mg·kg-1治療組及咯利普蘭1mg·kg

2、-1治療組，術(shù)后6小時腹腔注射首次給藥。通過水迷宮和抑制回避實驗測試其學(xué)習(xí)記憶水平，2周后將大鼠處死灌注固定后行尼氏染色進行腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察，制備腦組織勻漿，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）檢測大鼠海馬組織PDE活性。（2）分離培養(yǎng)海馬神經(jīng)祖細(xì)胞，采用Nestin抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色對細(xì)胞進行鑒定。運用MTT及流式細(xì)胞術(shù)的方法觀察不同濃度咯利普蘭處理對細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞分化的檢測采用NF和GFAP的免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 結(jié)果：

3、（1）大鼠海馬腦組織經(jīng)尼氏染色結(jié)果表明，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量眾多，緊密整齊排列。形態(tài)正常，細(xì)胞著色均勻，細(xì)胞膜完整，胞核飽滿，胞仁清晰。神經(jīng)元核仁及核周圍質(zhì)著色深，神經(jīng)細(xì)胞周圍的神經(jīng)纖維無空泡。I-R組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散紊亂，層次不清，細(xì)胞間隙增寬，神經(jīng)元變性明顯，出現(xiàn)胞膜皺縮，胞質(zhì)變空，胞核固縮、溶解。壞死細(xì)胞留下許多腔隙，細(xì)胞間隙明顯增寬；缺血邊緣區(qū)神經(jīng)元腫脹、著色淡，形態(tài)變?yōu)榻切位蛏刃危猩⒃诨虼笃纳窠?jīng)元缺

4、失現(xiàn)象。而經(jīng)咯利普蘭治療后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列和形態(tài)均較I-R組明顯改善，其中以咯利普蘭0.3 mg·kg-1組更為顯著；Morris水迷宮實驗中，在訓(xùn)練的第2天至第5天模型組大鼠的潛伏期與假手術(shù)組比較均差異有顯著性，即模型組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比需要更長的時間找到平臺，分別為63±16s、38±16s、26±12s、18±8s。而經(jīng)咯利普蘭0.3 mg·kg-1治療后潛伏期分別縮短至36±23s、16±13s、17±12s、7±2

5、s；經(jīng)咯利普蘭1 mg·kg-1治療后潛伏期分別縮短為41±13s、22±10s、17±12s、11±2s?？臻g探索實驗中，與對照組相比，I-R組大鼠90s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)（2.3±0.8次）和在原平臺所在象限（即目的象限）的總探索時間均明顯縮短（19±5s），表明I-R組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降；而經(jīng)咯利普蘭0.3 mg·kg-1及1mg·kg-1治療后其90s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)（4.3±1.8次、4.0±1.4次）和在原平

6、臺所在象限（即目的象限）的總探索時間均明顯延長（25±3s、24±3s）；避暗實驗中，模型組大鼠的潛伏期顯著降低（64±35s），錯誤次數(shù)顯著增加（1.4±1.0次）；咯利普蘭0.3 mg·kg-1及1mg·kg-1治療組均顯著增加了模型大鼠的潛伏期（141±54s、138±71s），錯誤次數(shù)顯著減少（0.6±0.5次、0.7±0.8次）；HPLC檢測結(jié)果顯示：與正常對照組相比，模型組PDE活性顯著升高（16.1±0.9μmol.g-1

7、.min-1）；與模型組相比，咯利普蘭0.3 mg·kg-1及1mg·kg-1治療組PDE活性顯著降低（13.8±15μmol.g-1.min-1、14.1±0.7μmol.g-1.min-1）。（2）結(jié)合海馬神經(jīng)祖細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)特征及神經(jīng)巢蛋白（Nestin）抗原的鑒定結(jié)果，確認(rèn)分離培養(yǎng)的為神經(jīng)祖細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示：咯利普蘭10μM、20μM、40μM三個劑量組均能夠促進神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，其A值由對照的0.481±0.07

8、7依次增加到0.675±0.048、0.677±0.111、0.684±0.059，且溶媒（1%的DMSO）并不影響所培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：檢測未加入咯利普蘭的單細(xì)胞懸液（對照組）其增殖指數(shù)為52.04%，而加入10μM、20μM、40μM的咯利普蘭的單細(xì)胞懸液其增殖指數(shù)分別增加為60.46%、64.11%、68.58%，進一步表明咯利普蘭可促進神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞在添加血清誘導(dǎo)分化6小時左右即可見

9、原本懸浮生長的神經(jīng)球迅速增大并開始貼壁、展開，7天時已分化成大量的神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)樣細(xì)胞。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定可見分化細(xì)胞呈“NF”及“GFAP”陽性，表明神經(jīng)祖細(xì)胞具有多分化潛能，可分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后對NF陽性細(xì)胞及GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示：對照組在含有10%胎牛血清的分化培養(yǎng)基中分化7天其NF陽性細(xì)胞數(shù)為11個，而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為17個，即主要分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。而加入40μM

10、、20μM、40μM三個濃度的咯利普蘭分化培養(yǎng)后，大部分細(xì)胞分化為神經(jīng)元。其NF陽性細(xì)胞數(shù)分別增加至：22、23、26個，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)沒有顯著差別。表明咯利普蘭能夠促進神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。 結(jié)論：全腦缺血再灌注損傷能夠引起海馬組織嚴(yán)重?fù)p傷，并導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。神經(jīng)元缺失可能是其導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的病理基礎(chǔ)。并且在全腦缺血再灌注損傷后其PDE活性上升。而經(jīng)咯利普蘭治療能夠改善缺血