糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)和酵母態(tài)基因表達(dá)差異的研究.pdf

1、背景：近年來(lái)，馬拉色菌越來(lái)越引起真菌學(xué)家和臨床醫(yī)學(xué)家的關(guān)注，它是一類可引起多種皮膚病的嗜脂性真菌，馬拉色菌除可引起花斑糠疹、馬拉色菌毛囊炎外尚可引起頭皮糠疹、甲真菌病、龜頭包皮炎、真菌血癥、皮膚膿腫等。與誘發(fā)脂溢性皮炎、特應(yīng)性皮炎、頭皮糠疹的免疫機(jī)制密切相關(guān)，可能與融合性網(wǎng)狀乳頭瘤病相關(guān)，并與銀屑病的發(fā)病和加重相關(guān)，在嚴(yán)重免疫缺陷及靜脈營(yíng)養(yǎng)患者尚可引起系統(tǒng)性感染。但馬拉色菌致病分子機(jī)制至今尚未闡明，相關(guān)基因表達(dá)比較研究亦尚未見(jiàn)報(bào)道。

2、 馬拉色菌最常導(dǎo)致的疾病為花斑糠疹，在花斑糠疹患者皮損刮取鱗屑直接鏡檢查見(jiàn)的馬拉色菌大多呈菌絲態(tài)，而在健康人皮膚上則基本以酵母態(tài)形式存在，這種菌形不同的原因目前還不清楚，推測(cè)可能與局部環(huán)境(溫度、濕度、皮脂成分)不同有關(guān)。故糠秕馬拉色菌在機(jī)體內(nèi)外因素的作用下由酵母態(tài)轉(zhuǎn)化成菌絲態(tài)很可能是臨床致病的關(guān)鍵所在。在已公認(rèn)的馬拉色菌7個(gè)種中，糠秕馬拉色菌較為常見(jiàn)，其菌絲態(tài)在試管內(nèi)已被成功地誘導(dǎo)出，它也是目前唯一的一種可在體外培養(yǎng)出菌絲態(tài)的馬拉

3、色菌。通過(guò)比較糠秕馬拉色菌酵母態(tài)和菌絲態(tài)的差異將對(duì)了解馬拉而隨著微生物基因組序列的大量測(cè)定，通過(guò)比較基因表達(dá)差異分析致病微生物的分子致病機(jī)制已成為新近微生物基因組研究的熱點(diǎn)。近年發(fā)展起來(lái)的抑制消減雜交技術(shù)為比較同源生物的基因表達(dá)差異提供了一條新的途徑。 目的：本研究試圖應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)比較糠秕馬拉色菌的菌絲態(tài)和酵母態(tài)之間mRNA差異以分析糠秕馬拉色菌的菌絲態(tài)和酵母態(tài)的基因表達(dá)差異，建立糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)和酵母態(tài)細(xì)胞的差異表達(dá)

4、cDNA文庫(kù)，獲得其差異表達(dá)的基因片段，以了解其酵母態(tài)轉(zhuǎn)化為菌絲態(tài)的相關(guān)分子機(jī)理，為進(jìn)一步深入研究糠秕馬拉色菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：首先將糠秕馬拉色菌(M.furfur CBS 1878)標(biāo)準(zhǔn)株分別接種于菌絲態(tài)和酵母態(tài)液體培養(yǎng)基，3天后分別提取糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)和酵母態(tài)細(xì)胞的總RNA，從中分離出mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成菌絲態(tài)和酵母態(tài)細(xì)胞雙鏈cDNA，經(jīng)RsaⅠ酶切消化后，運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)進(jìn)行雜交，相同的片斷將被消減掉，經(jīng)

5、過(guò)2次抑制性PCR擴(kuò)增消減后片斷，獲得菌絲態(tài)或酵母態(tài)細(xì)胞差異表達(dá)的cDNA片段并建立差異文庫(kù)。然后對(duì)差異cDNA片段進(jìn)行克隆及斑點(diǎn)雜交鑒定，最后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序、在GenBank上進(jìn)行相似性對(duì)比和利用DNA序列分析軟件進(jìn)行序列分析。 結(jié)果： 1．成功培養(yǎng)出糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)。 2．獲得糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)和酵母態(tài)細(xì)胞的總RNA，并分離出其mRNA。 3．建立了菌絲態(tài)及酵母態(tài)細(xì)胞差異表達(dá)的cDNA文庫(kù)。

6、 4．經(jīng)菌落PeR和斑點(diǎn)雜交鑒定差異文庫(kù)，實(shí)際共得菌絲態(tài)陽(yáng)性克隆22個(gè)，酵母態(tài)陽(yáng)性克隆8個(gè)。 5．將上述30個(gè)鑒定陽(yáng)性克隆和4個(gè)正向消減雜交可疑陽(yáng)性克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)重復(fù)克隆11個(gè)，2個(gè)為載體序列，實(shí)際得有意義菌絲態(tài)特有片斷15個(gè)，酵母態(tài)特有片斷6個(gè)，用BLAST程序在GenBank中檢索這些基因片段序列的同源性，所有檢索到與其他物種蛋白或序列有一定相似度的克隆可分為以下幾類： ①生化代謝類：A4與ATP合酶、A16與N

7、ADH脫氫酶Ⅰ、A23與細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅲ、A38與線粒體序列、A49與NADH脫氫酶Ⅱ等有一定同源度。B4與線粒體肌酸激酶有一定相似性，B7與ATP合酶的β亞基同源(A4與ATP合酶α亞基同源)，B9則與原海豹霉屬的細(xì)胞色素b同源。 ②與轉(zhuǎn)錄有關(guān)：A8與剪接因子2或DNA結(jié)合蛋白相似，A13與可抑制白介素2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子8及鋅指蛋白具有高度同源，A14與核轉(zhuǎn)錄因子Y高度同源，與磷酸酯酶也具有一定同源性；A40與轉(zhuǎn)錄變體A

8、CTN2高度同源。 ③與生長(zhǎng)相關(guān)：A10與牛生長(zhǎng)因子受體α多肽序列同源，但BLASTx未找到同源蛋白。 ④細(xì)胞結(jié)構(gòu)類：A12與細(xì)胞壁相關(guān)水解酶及脂蛋白具有一定同源性，A22與大腸桿菌嗜菌體衣殼蛋白有一定同源性，與米曲霉的基因組序列部分相同。 ⑤其他類：A15與肌聯(lián)蛋白、A21與恥垢分支桿菌假設(shè)蛋白、A56與念珠棘蟲(chóng)屬赤霉GTP結(jié)合蛋白有很高的相似度，B3與蘇蕓金芽胞桿菌質(zhì)粒小部分序列相似，B10則有30％序列和玉

9、蜀黍黑粉菌、綠藻門(mén)小部分序列具有相似性，B12與構(gòu)巢曲霉的40S核糖體S7蛋白具有一定相似度。 6．獲得的這些序列經(jīng)過(guò)0miga 2.0等核酸序列分析軟件進(jìn)行正相3個(gè)和負(fù)相3個(gè)共6個(gè)相位的ORF搜索，發(fā)現(xiàn)所得序列均具有起始密碼子和終止密碼子，即為可能的開(kāi)放閱讀框(open reading framework，ORF)，翻譯后的6相位的氨基酸序列均含有大量真菌蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基序，表明所獲得的片斷均為編碼蛋白質(zhì)的基因片斷。