MIF轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞株及對其血管生成作用的影響.pdf

1、宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，全球發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來其發(fā)病呈現(xiàn)出明顯年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生存質(zhì)量。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是多效能的細(xì)胞因子，在炎癥、免疫反應(yīng)及腫瘤的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。目前研究認(rèn)為MIF是重要的促腫瘤因子，與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。本課題組前期實驗證實與Caski細(xì)胞株相比，SiHa細(xì)胞

2、株中MIF表達(dá)較低，進(jìn)行體外實驗表明MIF可能通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡等機(jī)制促進(jìn)宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 目的:構(gòu)建表達(dá)綠色熒光的pEGFP-N1/MIF真核表達(dá)載體，探討過表達(dá)MIF對宮頸癌SiHa細(xì)胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討MIF在宮頸癌細(xì)胞血管生成中的作用，初步探索MIF通過NF-κB信號通路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，可能為宮頸癌的診治提供理論依

3、據(jù)。
　　 方法:
　　 1.化學(xué)合成MIFcDNA，設(shè)計含XhoⅠ和BamH(Ⅰ)酶切位點的引物序列，利用PCR方法擴(kuò)增MIF基因片段，構(gòu)建人pEGFP-N1/MIF真核表達(dá)載體;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染到宮頸癌SiHa細(xì)胞株中，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，采用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染前后各組上清液中MIF蛋白的表達(dá)，用熒光定量PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中MIF mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 2.M

4、TT法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化，熒光定量PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　 3.用NF-κB抑制劑PDTC處理pEGFP-N1/MIF/SiHa細(xì)胞，采用MTT法檢測抑制前后各組細(xì)胞增殖能力的變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測抑制前后各組細(xì)胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.

5、經(jīng)過酶切及DNA測序鑒定證實pEGFP-N1/MIF真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF/SiHa真核表達(dá)載體6h后即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染48 h后熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因效率約為（61±2.0）％;ELISA檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF組細(xì)胞上清液中MIF蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05);熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF組細(xì)胞中MIF mRNA和蛋白表

6、達(dá)均過表達(dá)(P＜0.05)。
　　 2.MTT實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05);熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF組細(xì)胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)均過表達(dá)(P＜0.05)。
　　 3.NF-κB抑制劑作用于pEGFP-N1/MIF/SiHa細(xì)胞后，MTT實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/MIF組細(xì)胞增殖能力

7、明顯減弱(P＜0.05);免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示細(xì)胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。
　　 4.Pearson相關(guān)分析顯示:MIF與IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9之間，NF-κB與IL-8、VEGF、MMP9之間，IL-8與VEGF、MMP9之間均存在正相關(guān)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.將構(gòu)建成功的pEGFP-N

8、1/MIF真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞能顯著上調(diào)細(xì)胞中MIF的表達(dá);
　　 2.MIF可以明顯增強(qiáng)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖能力，并且顯著上調(diào)細(xì)胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白的表達(dá);
　　 3.NF-κB抑制劑PDTC能顯著抑制細(xì)胞的增殖能力，并且下調(diào)pEGFP-N1/MIF/SiHa細(xì)胞中MIF、IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9蛋白的表達(dá)。
　　 4.MIF與NF-κB