hepaCAM基因在膀胱癌中表達及對T24細胞生物學影響.pdf

1、第一部分 目的：探討hepaCAM基因在膀胱移行細胞癌(transitionalcellcarcinoma of the bladder，TCCB)中的表達及臨床意義。 方法：采用RT-PCR方法檢測28例正常膀胱對照和34例膀胱移行細胞癌中hepaCAM基因mRNA的表達；分析其與膀胱腫瘤臨床參數(shù)特征間的關系。 結果：hepaCAM基因在TCCB中表達明顯低與正常膀胱對照組(p＜0.01)，且與TCCB分級有關

2、(p＜0.05)，與臨床分期、性別、年齡及復發(fā)無關(P＞0.05)。 結論：hepaCAM基因在TCCB中表達降低或缺失，與膀胱癌發(fā)生發(fā)展有關，可能是檢測膀胱移行細胞癌一種新的輔助診斷指標。 第二部分 目的：野生型及缺失細胞外結構突變體hepaCAM基因真核表達載體pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt的鑒定，觀察轉(zhuǎn)染后野生型及突變hepaCAM蛋白在T24細胞中定位，獲得篩選穩(wěn)

3、定表達野生型及突變體蛋白的T24細胞的實驗方法。 方法：野生型及缺失細胞外結構突變體hepaCAM基因的重組真核表達載體pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt經(jīng)Hind III和Barn H I雙酶切及序列鑒定，轉(zhuǎn)染膀胱移行細胞癌T24細胞株，熒光顯微鏡計算脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞效率，激光共聚焦顯微鏡觀察hepaCAM蛋白及突變體hepaCAM-mt蛋白在T24細胞的定位。G418篩選穩(wěn)定表達目的蛋白的

4、細胞，Westem blot檢測蛋白表達。 結果：獲得含有野生型hepaCAM及突變體hepaCAM-mt的真核表達載體，建立穩(wěn)定、高效轉(zhuǎn)染T24細胞的方法。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細胞的最佳轉(zhuǎn)染時間為48h，最適合脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例為2:1。激光共聚焦顯示：單個廣泛延展細胞上，hepaCAM蛋白主要定位于核周區(qū)域及細胞突起表面；當細胞相互連接時，hepaCAM蛋白形成并指結構顯著分布在細胞膜表面相互接觸的突起上，呈現(xiàn)典型細胞粘附分子

5、特性。當細胞外區(qū)域缺失時，突變體hepaCAM-mt蛋白定位發(fā)生了明顯改變：在單個細胞中主要集中在細胞核周區(qū)域；細胞相互連接時，蛋白非特異性的分布于整個細胞中，而并非集中在細胞相互連接區(qū)域。篩選出穩(wěn)定表達野生型hepaCAM及其突變體蛋白的T24細胞，可以分別有效的表達hepaCAM蛋白及hepaCAM-mt蛋白。檢測到hepaCAM蛋白量約為75kDa，而hepaCAM-mt蛋白分子量約為50kDa。 結論：重組真核表達載體能

6、夠有效的轉(zhuǎn)染T24細胞，從而表達野生型hepaCAM蛋白及突變體hepaCAM-mt蛋白，為下一步研究hepaCAM基因在TCCB中的生物學作用奠定基礎。 第三部分 目的：探討hepaCAM及突變體hepaCAM-mt基因?qū)24細胞粘附力、活動力及增殖力影響。 方法：通過真核細胞轉(zhuǎn)染技術將含有野生型hepaCAM及突變體hepaCAM-mt的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染T24細胞，使用G418篩選穩(wěn)定表達細胞后，采用細胞粘

7、附實驗、細胞解離實驗探討hepaCAM基因及突變體對T24細胞粘附力的影響；通過基質(zhì)膠遷移實驗、傷口愈合實驗對T24細胞的活動力進行探討；通過細胞增殖實驗對轉(zhuǎn)染后T24細胞的增殖力進行研究，從而對hepaCAM及其突變體基因?qū)24細胞的生物學影響進行探討。 結果：穩(wěn)定表達野生型hepaCAM蛋白的T24細胞與表達突變體蛋白的細胞及陰性對照組相比，表現(xiàn)出明顯粘附力及活動力增強(p＜0.01)，并且具有明顯抑制T24細胞增殖的能力