靶向AR基因的RNA干擾誘導膀胱癌T24細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　 多年來關于膀胱癌的一個問題一直存在--為什么男性患者大約是女性患者的3倍之多?長期以來認為這要歸因于男性的高吸煙率和高風險的工作,但是隨著各行各業(yè)女性工作者和女性煙民數(shù)量的大量增加,這一差距并沒有改變。
　　 性激素在致癌過程中的作用日益引起人們的關注。最初對性激素的研究均注重于性激素的靶器官,如乳腺、卵巢、前列腺等。1984年Ahmed[1]證實在腎癌組織中存在雄激素受體(Androgen Rece

2、ptor,AR)、雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)和孕激素受體(ProgesteroneReceptor,PR),泌尿系腫瘤與性激素間的關系令人矚目。膀胱癌是泌尿系最常見的腫瘤,也是性別差異較大的腫瘤之一。隨著在膀胱癌組織中相繼發(fā)現(xiàn)了AR、ER和pR,有人認為性激素通過其受體在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中有一定作用。
　　 AR在人體組織分布很廣泛,除了在前列腺、精囊等生殖器官外,在中樞神經系統(tǒng)、骨骼肌以及腎臟

3、、肝臟組織中都存在AR。在人類的腫瘤中,前列腺癌、肝癌、大腸癌、黑色素瘤中都有AR。在膀胱癌組織中也有AR,李世文[3]等檢測64例膀胱移行細胞癌,AR陽性率為78.13％,高于17例正常膀胱粘膜AR陽性率41.18％;在64例膀胱癌中,8例Ⅰ級膀胱癌AR陽性率100％,27例Ⅱ級癌AR陽性率81.48％,29例Ⅲ-Ⅳ級癌.AR陽性率68.97％,提示膀胱癌AR陽性率隨腫瘤分級增加而降低。同時還發(fā)現(xiàn)同一患者的癌組織AR陽性率高于癌旁組織

4、及自身膀胱粘膜,原發(fā)腫瘤的AR陽性率高于復發(fā)腫瘤,程榮璇[6]等檢測93例膀胱移行細胞癌,AR陽性率為52.68％,AR陽性患者中多發(fā)性癌較高,非浸潤性癌的AR陽性率高于浸潤性癌,分化好的AR陽性率高于分化差的,并認為AR可能是膀胱癌新的生物學標記,檢測AR對預測膀胱癌預后有重要意義。
　　 化療藥物灌注膀胱誘導癌細胞凋亡已成為膀胱癌術后輔助治療的主要手段。然而臨床結果顯示灌注后仍有較高的復發(fā)率。其主要原因就是對化療藥物耐藥及敏

5、感性下降,導致細胞凋亡不足。有大量資料顯示,在許多腫瘤細胞的凋亡中發(fā)現(xiàn)有Caspase的活化。在此傳導途徑中起關鍵作用的caspase-3在許多正常組織和腫瘤組織中表達,而且許多腫瘤治療是通過caspase-3途徑介導的。Caspase-3表達下調導致膀胱癌細胞凋亡減少,可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[51-54]。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為一種高效的基因沉默技術,有望成為基因治

6、療的有效手段。通過RNAi實現(xiàn)對AR的沉默,能夠分析其在腫瘤中的作用:雄激素是否通過AR促進了膀胱癌細胞的增殖能力?AR與細胞周期調節(jié)和信號轉導之間的關系如何?其機制可能是什么?
　　 圓滿地解決這些問題,必然將找到預防和治療膀胱癌的新途徑,延長膀胱癌患者的生命,具有潛在的經濟與社會效益。
　　 正是在這樣的前提與背景下,本研究擬準備:
　　 ①研究雄激素對膀胱癌細胞株T24的生長的影響,其與AR表達之間的關系;

7、
　　 ②構建靶向于AR的慢病毒載體;
　　 ③探討AR在絲裂霉素C誘導膀胱癌T24細胞系凋亡中所發(fā)揮的作用及其與凋亡信號通路的聯(lián)系,從而為抑制膀胱癌細胞增殖治療和加強化療藥物對膀胱癌細胞的作用效果提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分:不同水平DHT對膀胱癌細胞株T24生長及其AR表達的影響
　　 目的：探討DHT對膀胱癌細胞株T24及其AR表達的作用。
　　 方法：采用細胞培養(yǎng)和RT-PCR方法研究不

8、同的DHT濃度(0、10-10M、10-9M、10-8M)對膀胱癌細胞株(T24)中ARmRNA的表達MTT法測細胞生長曲線,觀察其對細胞增殖的影響。
　　 結果：Real-time PCR擴增良好。溶解曲線圖中沒有出現(xiàn)雜峰,也未出現(xiàn)主峰的異常增寬,表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。分析數(shù)據(jù)提示不同DHT濃度對AR表達無明顯影響(P＞0.05)。而在不同水平DHT培養(yǎng)T24細胞第4天和第5天MTT檢測結果分析顯示光

9、吸收值無顯著性差異(P＞0.1)。
　　 小結：T24細胞表達AR;DHT濃度對AR表達無明顯影響;DHT對T24細胞無直接刺激增殖作用。
　　 第二部分:AR基因RNA干擾慢病毒載體制備
　　 目的：制備靶向于AR的干擾慢病毒載體,為進一步研究AR提供條件。
　　 方法：針對AR基因靶基因序列,利用公用網站按照RNA干擾序列設計原則,設計2個RNA干擾靶點序列,使用雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位

10、點粘端,直接連入酶切后的RNA干擾載體上。將連接好的產物轉入制備好的感受態(tài)細胞,對長出的克隆先進行PCR鑒定,在進行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。通過RT-PCR檢測兩種慢病毒載體感染T24細胞后,AR基因的表達情況。
　　 結果：通過陽性克隆測序,證實兩條序列構造載體分別成功。慢病毒滴度測定兩個病毒載體滴度分別為1E+9,2E+9 TU/mL。從熒光觀察結果可見:T24細胞的感染效率都達

11、到80％以上。T24細胞中,KD1,KD2組對AR基因的表達有顯著敲減效果。相對NC組,KD1,KD2組對AR基因敲減效率分別達到85％以上(P＜0.05)。
　　 小結：利用RNAi的理論和方法制備出2個靶向AR基因的慢病毒載體。
　　 第三部分:AR影響絲裂霉素誘導膀胱癌T24細胞系凋亡及其機制研究
　　 目的：探討AR在絲裂霉素誘導膀胱癌T24細胞系凋亡中所發(fā)揮的作用,從而為抑制膀胱癌細胞增殖治療和加強化療

12、藥物對膀胱癌細胞的作用效果提供實驗依據(jù)。
　　 方法：采用RNAi及MTT和流式細胞術(FCM)等方法觀察AR對絲裂霉素C誘導T24細胞凋亡的影響。Realtime RT-PCR技術檢測T24細胞中ARNRNA和caspase3mRNA的表達。
　　 結果：分別于轉染后RT-PCR檢測AR及caspase3的表達,ARmRNA顯著降低(P＜0.05),而caspase-3顯著增高(P＜0.05)。流式細胞儀檢測空白組、陰

13、性對照組及轉染組MMC作用的凋亡率結果,在不加化療藥物的情況下,單純轉染RNA干擾載體,細胞的凋亡率與轉染前相比稍有升高,在MMC的作用下,抑制AR的表達后,細胞的凋亡率可明顯升高,轉染組細胞凋亡率為(35.38±1.54)％,明顯高于空白組(15.67±1.23)％與陰性對照組(17.43±1.45)％,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 小結：AR-siRNA介導膀胱癌T24細胞系凋亡可能通過caspase途徑。AR明