HBV宮內(nèi)傳播和HBV基因突變關(guān)系的研究.pdf

1、目的：乙型肝炎呈世界范圍流行，我國屬高發(fā)區(qū)。其中母嬰傳播是HBV 的主要傳播途徑之一，也是人群中大量HBV 慢性攜帶者形成的重要原因。目前，由于乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白的使用，新生兒的感染率已明顯下降，但仍有5％－15％的新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染。其具體機(jī)制目前并不完全清楚，可能與病毒本身、母體和胎兒等各方面因素有關(guān)。本課題組多年從事HBV 宮內(nèi)傳播的研究，并提出了HBV 通過“細(xì)胞轉(zhuǎn)移”途徑感染胎兒的假說，但其具體生物學(xué)機(jī)制尚不完全清楚。本

2、課題組蘇海霞發(fā)現(xiàn)，非宮內(nèi)感染組母親HBV 前S/S 基因突變率要高于宮內(nèi)感染組母親。因而，運(yùn)用分子生物學(xué)的技術(shù)方法，從HBV 基因結(jié)構(gòu)入手，深入研究宮內(nèi)傳播中乙型肝炎病毒的基因突變，結(jié)合臨床與流行病學(xué)的資料，分析HBV 基因異質(zhì)性與宮內(nèi)感染的關(guān)系，篩選可能與宮內(nèi)感染有關(guān)的特異性基因結(jié)構(gòu)，將為HBV 宮內(nèi)傳播機(jī)制的研究提供新的思路，對預(yù)防HBV 宮內(nèi)感染的發(fā)生具有重要的理論和實(shí)踐意義。 方法 1.HBsAg 陽性孕婦及其足

3、月分娩的新生兒外周血的收集：2004 年8 月－2006年6 月收集陜西省婦幼保健院婦產(chǎn)科足月分娩的HBsAg 陽性孕婦及其新生兒外周血。根據(jù)新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染與否，將其母親分為宮內(nèi)感染組和未感染組。 2.血清HBV 標(biāo)志物的檢測以及血清HBV DNA 的提取：采用ELISA 法檢測HBV 標(biāo)志物,并采用酚－氯仿抽提法提取血清HBV DNA，作為PCR 的模板。 3.目的片段的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR 擴(kuò)增)與克?。涸O(shè)計(jì)引物

4、對HBV 前S/S、前C/C 基因2.5Kb 目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，膠回收PCR 產(chǎn)物，與pGM T 載體連接。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素和X-gal 藍(lán)白斑法篩選陽性菌落，并提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定。 4.DNA 測序與種系進(jìn)化樹分析：選擇經(jīng)鑒定pGM T 載體內(nèi)插入2.5Kb 產(chǎn)物的菌液送檢測序，應(yīng)用MegAlign 軟件將獲得的測序結(jié)果與GenBank 中HBV標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較，構(gòu)建種系進(jìn)

5、化樹。 5.核苷酸和氨基酸序列的組間比較分析：按照宮內(nèi)感染組母親、被感染的患兒和未感染組母親，將基因序列的測序結(jié)果進(jìn)行分組比較，比較各組之間突變發(fā)生的分布情況和核苷酸、氨基酸序列的差異。分析其對宮內(nèi)感染的發(fā)生可能造成的影響。 結(jié)果 2.1 一般情況共得到宮內(nèi)感染組2 例母親（Ⅰ組）及其被感染的患兒（Ⅱ組），未感染組8 例母親（Ⅲ組）。宮內(nèi)感染組母親和未感染組母親HBsAg OD 值兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t 檢驗(yàn)，t

6、=0.667，P=0.518），HBeAg OD 值兩組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.636，P=0.140）。 2.2 所有12 例研究對象經(jīng)PCR 擴(kuò)增均得到2.5Kb HBV 基因組DNA 片段，連接、轉(zhuǎn)化后，感染組每例母嬰各隨機(jī)選取4－6 個(gè)陽性克隆，未感染組每例母親各隨機(jī)選取2－3 個(gè)克隆進(jìn)行測序，成功得到41 株克隆的測序結(jié)果，其中Ⅰ組：10 株；Ⅱ組：10 株；Ⅲ組：21 株。 2.3 HBV的基因分型通過對4

7、1 株HBV 序列的前S/S 區(qū)基因序列和GenBank中A－H 基因型標(biāo)準(zhǔn)株的前S/S 區(qū)序列構(gòu)建種系進(jìn)化樹，全部HBV 株與C基因亞型標(biāo)準(zhǔn)序列（M12906）的進(jìn)化距離最接近，而且與M12906 的相似率最高，為96.5％－98.8％，屬于C 基因型。根據(jù)HBsAg 第122 位和160 位氨基酸，判定所有序列血清型為adr 亞型。 2.4 HBV 前S/S 基因、前C/C 基因突變方式及比較將41 株HBV 序列與C型標(biāo)準(zhǔn)

8、株M12906 比對，對前S/S 基因、前C/C 基因所發(fā)生的突變進(jìn)行歸類分析。所有突變主要以替代為主，插入和缺失僅散在見于不同株的個(gè)別位點(diǎn)。 2.5 可能與HBV 宮內(nèi)感染有關(guān)的突變位點(diǎn)通過對宮內(nèi)感染組母親、宮內(nèi)感染組患兒和未發(fā)生宮內(nèi)感染組母親序列進(jìn)行比較，篩選了可能與HBV 宮內(nèi)感染有關(guān)的19 個(gè)位點(diǎn)，這19 個(gè)位點(diǎn)的突變在三組之間的發(fā)生比存在顯著差別（Fisher 精確檢驗(yàn)，P＜0.05），且19 個(gè)位點(diǎn)中，除nt3026

9、 外，其余位點(diǎn)的突變僅見于未感染組母親。其中發(fā)生錯(cuò)義突變的位點(diǎn)有11 個(gè)，發(fā)生無義突變的位點(diǎn)有2 個(gè)，其余為沉默突變。Nt2875 和nt3026 突變分別引起前S1 區(qū)K10Q和V60A 的氨基酸替代；nt3212 突變使前S2 區(qū)aa3 W 變?yōu)榻K止碼；nt287、nt339、nt435、nt531、nt810 等五個(gè)位點(diǎn)突變分別引起S 區(qū)T45A、L62P、P94L、T126I、S219F 氨基酸替代，其中僅T126I 替代位于“

10、a”決定簇（aa124-147）表位內(nèi)。Nt1913、nt2149、nt2159、nt2189 等四個(gè)位點(diǎn)突變引起C 區(qū)T5P、D83E、G87S、L97I 氨基酸替代；nt2444 突變使C 區(qū)aa182Q 變?yōu)榻K止碼。 上述13 個(gè)位點(diǎn)中nt3212、nt287 和nt435 在CTL 細(xì)胞表位，nt1913、nt2149在CD4+Th 細(xì)胞表位，nt2159、nt2189 在B 細(xì)胞表位。 2.6 突變對宮內(nèi)感染可

11、能造成的影響HBV 前S1 區(qū)的nt2875，nt3026 的突變可能引起胎盤細(xì)胞對HBV 的不識別或是HBV 感染胎盤細(xì)胞失?。磺癝2 區(qū)nt3212 突變可能使病毒顆粒在未感染組母親體內(nèi)分泌減少，降低了病毒對宿主胎盤細(xì)胞的壓力；S 區(qū)和C 區(qū)位點(diǎn)的突變可能使突變株的免疫反應(yīng)性下降，影響HBsAg-抗-HBs 復(fù)合物的形成，使之不能與相應(yīng)的IgG-Fc 受體或補(bǔ)體成分C3c 結(jié)合，因而不能“逐層轉(zhuǎn)移”至胎兒絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，胎兒免

12、獲感染。 結(jié)論 1.宮內(nèi)感染組母親和未感染組母親體內(nèi)的HBV 病毒株序列不完全相同；篩選了可能與HBV 感染有關(guān)的19 個(gè)位點(diǎn)，除nt3026 外，其余位點(diǎn)的突變僅見于未感染組母親。提示不具有上述突變的病毒株在宮內(nèi)傳播中可能具有選擇優(yōu)勢。 2.上述發(fā)生錯(cuò)義突變和無義突變的13 個(gè)位點(diǎn)分布不同，提示不同區(qū)域氨基酸在HBV 通過胎盤的過程中發(fā)揮著不同的作用。HBV 宮內(nèi)感染的發(fā)生可能與某些基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變或其所在