HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)和相關(guān)miRNA研究.pdf

1、我國(guó)是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高流行區(qū)，HBV感染及其導(dǎo)致的肝硬化和肝癌等疾病嚴(yán)重影響人們的健康。HBV主要通過(guò)血液、母嬰及性接觸傳播，其中母嬰垂直傳播主要發(fā)生在圍產(chǎn)期，阻斷母嬰傳播是目前控制HBV感染流行的關(guān)鍵，而HBV宮內(nèi)跨胎盤(pán)傳播機(jī)制是母嬰傳播阻斷研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制主要有胎盤(pán)滲漏學(xué)說(shuō)、胎盤(pán)感染學(xué)說(shuō)及外周血單核細(xì)胞感染學(xué)說(shuō)等幾種假說(shuō)，但病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)

2、化過(guò)程，多層次多個(gè)分子可能參與該過(guò)程，目前有關(guān)HBV跨胎盤(pán)宮內(nèi)感染的機(jī)制研究尚不夠深入也遠(yuǎn)未闡明，亦無(wú)有效阻斷措施，深入探討HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制對(duì)于HBV宮內(nèi)跨胎盤(pán)傳播的有效阻斷具有理論和實(shí)際意義。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用來(lái)比較疾病與正常蛋白質(zhì)樣品間的表達(dá)水平，是揭示疾病分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)診斷標(biāo)志物以及尋找藥物新靶標(biāo)的有效平臺(tái)，尚未見(jiàn)HBV宮內(nèi)跨胎盤(pán)傳播機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道。此外，病毒感染宿主細(xì)胞后，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞中的miRNA表達(dá)

3、譜發(fā)生變化，HBV和宿主細(xì)胞之間通過(guò)miRNA進(jìn)行的相互調(diào)節(jié)對(duì)于HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生發(fā)展可能具有一定作用，亦未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。
　　因此，本論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選HBV陽(yáng)性產(chǎn)婦胎盤(pán)差異表達(dá)蛋白，并建立胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞體外HBV感染模型，探討HBV感染后細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化，從蛋白質(zhì)組和miRNA兩個(gè)層次深入探討HBV如何跨胎盤(pán)宮內(nèi)傳播，可望從新的角度對(duì)HBV宮內(nèi)跨胎盤(pán)傳播的機(jī)制予以揭示。
　　方法：
　　1．以

4、HBV陽(yáng)性產(chǎn)婦胎盤(pán)為研究對(duì)象，以正常產(chǎn)婦胎盤(pán)為對(duì)照，利用MALDI-TOF和ESI-MS/MS進(jìn)行分析，建立正常胎盤(pán)蛋白雙向電泳（2-DE）參考圖譜；采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，篩選HBV陽(yáng)性與正常產(chǎn)婦胎盤(pán)組織的差異表達(dá)蛋白，分析評(píng)價(jià)部分差異蛋白在HBV跨胎盤(pán)傳播中的功能及意義。
　　2．體外培養(yǎng)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞（JEG-3），應(yīng)用HBV陽(yáng)性血清處理，采用ELISA法檢測(cè)感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)細(xì)胞中HBs

5、Ag蛋白的表達(dá)、PCR法檢測(cè)細(xì)胞中HBV DNA的表達(dá)、AnnexinⅤ/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化并尋找病毒顆粒。
　　3．應(yīng)用HBV陽(yáng)性血清處理JEG-3細(xì)胞，采用miRNA芯片進(jìn)行處理前后細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的比較，并對(duì)差異miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和生物學(xué)功能分析。
　　結(jié)果：
　　1．建立了正常足月胎盤(pán)總蛋白2-DE參考圖譜；在pH4-10的合成圖譜上檢測(cè)到405個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，

6、鑒定出157個(gè)蛋白點(diǎn)對(duì)應(yīng)的104個(gè)蛋白，其中24個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)多個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞支架蛋白等；所鑒定蛋白質(zhì)中有部分功能不明蛋白質(zhì)存在。共篩選出HBV感染產(chǎn)婦胎盤(pán)蛋白中的56個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，鑒定出24個(gè)差異蛋白；差異蛋白中有14個(gè)表達(dá)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)；差異蛋白質(zhì)中包括了酶類(lèi)、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、支架蛋白、保護(hù)蛋白及功能未知蛋白等。
　　2．HBV陽(yáng)性血清處理后，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞JEG-3培養(yǎng)上清中HBsAg呈陽(yáng)

7、性；JEG-3細(xì)胞中HBsAg和HBV DNA呈陽(yáng)性；HBV陽(yáng)性血清處理后細(xì)胞壞死率顯著增加，凋亡率無(wú)明顯變化；HBV陽(yáng)性血清處理后JEG-3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多空泡狀結(jié)構(gòu)，溶酶體明顯增多，并可見(jiàn)病毒樣顆粒。
　　3．與正常血清處理細(xì)胞相比，HBV陽(yáng)性血清處理后JEG-3細(xì)胞中高表達(dá)的miRNA包括：has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-20a、has-mi

8、R-210和has-miR-574-3p；未發(fā)現(xiàn)差異顯著的低表達(dá)has-miRNA。
　　結(jié)論：
　　1．成功建立了正常足月胎盤(pán)總蛋白2-DE參考圖譜；鑒定得到104個(gè)蛋白質(zhì)，其中部分蛋白質(zhì)可能存在較多翻譯后修飾，其修飾的多樣性反映出這些蛋白在胎盤(pán)發(fā)育中的重要性；發(fā)現(xiàn)功能不明蛋白在胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中的存在。篩選鑒定得到HBV感染產(chǎn)婦胎盤(pán)蛋白表達(dá)譜中的24個(gè)差異蛋白；其中包括多種類(lèi)別，熱休克蛋白、肌動(dòng)蛋白、膜聯(lián)蛋白等差異蛋白可能與

9、HBV跨胎盤(pán)傳播有關(guān)。
　　2．HBV陽(yáng)性血清可導(dǎo)致體外培養(yǎng)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的HBV感染，建立與體內(nèi)HBV感染胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞條件接近的細(xì)胞感染模型；HBV陽(yáng)性血清可導(dǎo)致胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)溶酶體大量增多等形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，并可導(dǎo)致細(xì)胞壞死。
　　3．HBV陽(yáng)性血清處理胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞后，細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，差異表達(dá)的miRNA包括：has-miR-197、has-miR-32、has-miR-125a-3p、has-miR-