新生兒急性呼吸窘迫綜合征血清microRNA譜的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在篩選新生兒ARDS血清中差異表達的miRNAs,并評估利用篩選出的血清miRNAs作為新生兒ARDS早期診斷標志物的可行性。
　　研究方法:
　　本研究共分兩個部分。
　　第一部分:收集新生兒ARDS患兒血清各50例,健康新生兒血清32例,隨機選取9例病例組(ARDS組)及3例健康對照組(NC組)的血清,提取血清總RNA(含有miRNAs),利用miRNA芯片篩選出ARDS相對于正常組的

2、差異性miRNAs表達譜。根據(jù)預(yù)設(shè)的條件,從初步篩選出的miRNAs中進一步篩選以進行第二部分的研究。
　　第二部分:隨機選取18例ARDS及17例NC組新生兒的血清標本,采用TaqManqRT-PCR的方法對第一部分中篩選出的2種候選miRNAs進行定量研究和驗證,比較這兩種miRNAs的表達水平在各組間的差異是否與芯片結(jié)果一致,并對其檢驗效能進行評價。
　　實驗結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、兩組血清樣本均可

3、提取出合格的RNA
　　分別從ARDS組及NC組血清中提取總RNA,采用分光光度法檢測OD260/280,比值均符合要求。
　　2、總RNA與miRNA芯片雜交
　　用ARDS組及NC組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交,得到9張成像均勻、清晰的雜交圖像,可證實總RNA中含有miRNAs。
　　3、miRNAs在ARDS組及NC組血清中表達存在差異
　　采用GenePixproV6.0軟件,對探針點的初始

4、熒光強度進行分析,然后對初始強度值進行標準化及歸一化處理,篩選出兩組間差異表達的miRNAs。以表達水平變化倍數(shù)R≥2為界,共有318種差異表達的miRNA,其中132種在ARDS病例組相對于健康對照組上調(diào),186種下調(diào)。
　　4、篩選出兩種候選miRNAs
　　以表達水平變化倍數(shù)R≥15為界,將上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)在前5位的miRNAs選出,計算標準值A(chǔ)RDS-NC,最后篩選出兩種miRNA作為候選的血清學標志物。
　　第

5、二部分:
　　1、各血清標本中均可提取出合格的RNA
　　兩組血清標本提取的總RNA,OD260/280的比值均符合要求。
　　2、外參基因表達穩(wěn)定
　　參考文獻,初步選定線蟲miR-39作為外參基因。通過檢測其在各標本間的表達水平,結(jié)果顯示,兩組間外參的Ct值未見顯著性差異。
　　3、候選miRNAs的初步驗證與篩選
　　外參線蟲miR-39及目標miRNA均能有效擴增。以參線蟲miR-39為外參,

6、對各miRNAs的表達水平進行標準化分析,通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),第一部分實驗中篩選出的miR-3120及miR-20a在ARDS組及NC組之間的表達存在顯著性差異,芯片與PCR結(jié)果一致。
　　4、miR-3120及miR-20a的檢驗效能
　　以此次入組的血清樣本為基礎(chǔ)(N=35),利用ROC曲線分析miR-20a及miR-3120對ARDS和健康對照組的鑒別效能。結(jié)果顯示,miR-20a通過ROC分析得到的最佳cut-off

7、值為82.1,敏感性和特異性分別為94.1％和94.4%,得到的曲線下面積(AUC)為0.99;miR-3120的最佳cut-off值為27.3,敏感性和特異性分別為50.0%和70.6%,得到的曲線下面積(AUC)為0.52。
　　結(jié)論:
　　1、新生兒ARDS患者及健康對照血清中均有miRNAs的表達;
　　2、芯片檢測發(fā)現(xiàn),某些miRNAs的血清表達水平在ARDS組及健康對照組之間存在顯著性差異,本實驗篩選出31