辛伐他汀對不同缺氧條件下大鼠BMECs通透性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 缺血缺氧性腦損傷是臨床上最常見的腦血管疾病，血管再通后由于再灌注的作用，損傷表現(xiàn)更著，研究其可能的改善及治療辦法具有非常重要的價(jià)值。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductaseinhibi-tors，HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一種臨床上廣泛使用的降血脂藥物。近年來基于其一系列非調(diào)脂性腦缺血保護(hù)效應(yīng)，而被廣泛應(yīng)用于缺血性

2、腦血管病。一研究發(fā)現(xiàn)它具有重要的逆向作用，可減輕產(chǎn)生于腦缺血和再灌注期腦血管和腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的許多病理生理過程。動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)：他汀類藥物可明顯減小缺血腦損傷大鼠腦梗死面積，顯著減輕其腦水腫程度、改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸。血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)是維持腦內(nèi)微環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)，作為其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)與外周血管內(nèi)皮細(xì)胞不同，在基因、蛋白質(zhì)

3、組水平及生理結(jié)構(gòu)上均有其特異性。該結(jié)構(gòu)的損傷必將導(dǎo)致腦內(nèi)微環(huán)境的變化，從而引起腦神經(jīng)細(xì)胞功能、代謝與結(jié)構(gòu)的改變。而BBB損傷中，通透性變化是最基本的，也是最直接的損傷體現(xiàn)。因此，探討他汀對不同缺氧狀態(tài)下BMECs通透性的影響，能針對性地從細(xì)胞水平研究上述動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能機(jī)制。本課題擬構(gòu)建BMECs短暫缺氧(transienthypoxia，TH)、持續(xù)低氧(continuoushypoxia,CH)、復(fù)氧(reoxygenation,

4、R)模型，觀察不同缺氧條件下及他汀類干預(yù)后BMECs單層通透性的變化，及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetallopro-teinase,MMP-9)、誘導(dǎo)型-氧化氮合酶(induce dnitricoxide synthase,iNOS)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)的表達(dá)情況，并探討他汀類對不同缺氧條件下BMECs單層通透性影響可能相關(guān)機(jī)制，為解釋其減輕不同氧條件下腦損傷

5、的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 采用2次酶消化加20％BSA離心法分離培養(yǎng)SD大鼠BMECs，用不同缺氧缺糖條件建立BMECsTH、CH、R模型。其中TH組為低糖DMEM培養(yǎng)基環(huán)境，置于37℃的3％O2、5％CO2、92％N2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h；CH組為無糖Krebs溶液環(huán)境，低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；R組同CH組處理12h后，更換低糖DMEM培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧4h。采用BSA通透實(shí)驗(yàn)、跨

6、內(nèi)皮電阻(transendothelialelectricalresistance，TEER)測量并結(jié)合CCK-8細(xì)胞增殖活性測定以了解不同缺氧條件下BMECs通透性的變化及辛伐他汀(0.1、1.0、10μmol/L)、iNOS抑制劑：硫酸甲基異硫脲(SMT)、MMP-9抑制劑I(MI)、HIF-1α抑制劑：三羥基異黃酮(GEN)干預(yù)后的影響；采用iNOS試劑盒測定各組iNOS活性；免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法測定MMP-9、HIF-1α表達(dá)，激

7、光共聚焦顯微鏡攝影后進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析。 研究結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一： 1.BMECs形態(tài)觀察及鑒定：BMECs呈緊密連接的鋪路石樣單層生長；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測vWF蛋白呈陽性表達(dá)，陽性率可達(dá)95％；生長高峰在3～6d。原代BMECs具有很強(qiáng)的屏障特性。與其相比，第4代后TEER值有顯著性下降(P＜0.05)。 2.不同缺氧條件下BMECs的觀察：(1)BSA通透率顯示復(fù)氧4hBMECs通透率達(dá)到高峰，后緩慢

8、下降。TEER測定結(jié)果與其一致。(2)與N組相比，TH組、CH組、R組細(xì)胞變圓脫落數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞間隙逐漸增大；辛伐他汀干預(yù)后各組細(xì)胞形態(tài)有不同程度改善。N、TH、CH、R組TEER值逐漸降低(P＜0.05)，CCK-8細(xì)胞增殖活性逐漸增加(P＜0.05)。除0.1μmol/L辛伐他汀對R組BMEC的TEER及增殖活性無顯著改變外，各濃度辛伐他汀干預(yù)能明顯改善BMECS的TEER值及細(xì)胞增殖活性(P＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)二：

9、 1.TEER及細(xì)胞增殖活性比較10μmol/L辛伐他汀干預(yù)能顯著改善TH、CH、R組的TEER值及細(xì)胞增殖活性(P＜0.05)。MI、GEN干預(yù)后，TH組TEER值、細(xì)胞增殖活性與對照并無顯著差異(P＞0.05)。經(jīng)MI、SMT、GEN干預(yù)后，CH、R組TEER、細(xì)胞增殖活性均有顯著改善(P＜0.05)。 2.MMP-9表達(dá)比較MMP-9陽性者于胞漿呈現(xiàn)綠色熒光。與N組對照細(xì)胞相比，TH、CH、R組MMP-9表達(dá)逐漸增加(

10、P＜0.05)。辛伐他汀干預(yù)可降低TH組MMP-9表達(dá)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。辛伐他汀干預(yù)能明顯降低CH組、R組MMP-9表達(dá)(P＜0.05)；SMT、GEN干預(yù)能明顯降低TH、CH、R組MMP-9表達(dá)(P＜0.05)；MI干預(yù)后各組MMP-9表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。與MI干預(yù)后的MMP-9表達(dá)相比，CH、R組中SMT、GEN干預(yù)后MMP-9表達(dá)更低(P＜0.05)。辛伐他汀干預(yù)后MMP-9與TEER值的Pearson相

11、關(guān)系數(shù)為-0.875，p=0.000。 3.iNOS活性比較與N組對照細(xì)胞相比，TH、CH、R組iNOS活性逐漸增加(P＜0.05)。辛伐他汀、MI、SMT、GEN干預(yù)能明顯降低CH組、R組iNOS活性(P＜0.05)。與SMT干預(yù)后的iNOS活性相比，R組中GEN干預(yù)后的iNOS活性更低(P＜0.05)。辛伐他汀干預(yù)后iNOS活性與TEER值的Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.652，p=0.001。 4.HIF-1α表達(dá)

12、比較HIF-1α陽性者于胞核呈現(xiàn)紅色熒光。N組細(xì)胞幾乎無HIF-1α表達(dá)，而TH、CH、R組HIF-1α表達(dá)逐漸增加(P＜0.05)。經(jīng)辛伐他汀、MI、SMT干預(yù)后能明顯增加TH組HIF-1α表達(dá)(P＜0.05)，CH、R組HIF-1α表達(dá)略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。GEN干預(yù)后TH、CH、R組HIF-1α表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，與辛伐他汀、MI、SMT干預(yù)后各組均有顯著差異(P＜0.05)。辛伐他汀干預(yù)后HIF-1

13、α表達(dá)與TEER值的Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.836，P=0.000。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)SD大鼠BMECs，并建立了BMECs體外短暫缺氧、持續(xù)缺氧及缺氧復(fù)氧模型。BSA通透實(shí)驗(yàn)及TEER測量表明，通透性研究宜采用第四代以前的細(xì)胞。三種缺氧模型的BMECs通透性逐漸增加，細(xì)胞增殖活性逐漸降低。 2.除低濃度辛伐他汀對復(fù)氧條件下BMECs的通透性改善作用不明顯外，三種濃度辛伐他汀可呈濃度依賴性改善

14、不同缺氧條件下BMECs的通透性。 3.抑制iNOS活性可改善BMECs在不同缺氧條件下通透性的增加；MMP-9及HIF-1α表達(dá)與持續(xù)缺氧、復(fù)氧條件下BMECs的通透性增加有關(guān)，但輕度缺氧條件下，提高HIF-1α表達(dá)反而可能降低BMECs的通透性。缺氧條件下BMECs的MMP-9、iNOS活性可能與HIF-1α有關(guān)，而MMP-9的表達(dá)亦可能受iNOS活性的調(diào)節(jié)。 4.辛伐他汀對短暫缺氧條件下BMECs的通透性改善作用可