缺氧條件下VECs對NSCs增殖、分化和凋亡的影響.pdf

1、目的：研究大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)對體外缺氧海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖、分化和凋亡的影響，為VECs和NSCs共培養(yǎng)移植治療缺血缺氧性疾病提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1、新生1～3d的Wistar大鼠大腦海馬培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，采用免疫組織化學(xué)方法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。 2、取出生1～7d的Wistar大鼠大腦培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對其鑒定。 3、將培養(yǎng)傳代純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用0.

2、25％胰酶消化成單細(xì)胞液后接種于涂有多聚賴氨酸包被的蓋玻上，接種傳3代后用胰酶消化的神經(jīng)干細(xì)胞，以1:10接種比例加入神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液共培養(yǎng)在。 4、用無菌石蠟油覆蓋于低糖細(xì)胞培養(yǎng)液表面，制備低氧低糖溶液。對照組：正常神經(jīng)干細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)；缺氧共培養(yǎng)組：取共培養(yǎng)3d細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，用無菌Hank's緩沖液清洗2次，加入低氧低糖溶液共同作用2h、4h、8h和28h后換液，用PBS緩

3、沖液沖洗3次后，換神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)；缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組：取傳3代的神經(jīng)手細(xì)胞，用無菌Hank’s緩沖液清洗2次后，方法同上。 5、免疫組織熒光鑒定缺氧條件下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與凋亡，免疫組織化學(xué)鑒定缺氧條件下神經(jīng)干細(xì)胞的分化。 結(jié)果： 1、NSCs和VECs培養(yǎng)及鑒定：原代分離的單個(gè)NSC 4d增生為神經(jīng)細(xì)胞球，傳代后，經(jīng)nestin免疫熒光染色，細(xì)胞球呈陽性；原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

4、6-8d：長滿瓶壁，細(xì)胞呈多角形或扁平梭形，核卵圓形，Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性。 2、各組神經(jīng)干細(xì)胞光鏡形態(tài)變化特點(diǎn)：正常對照組NSCs胞體飽滿，折光性強(qiáng)，周圍有光暈。缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組NSCs胞體腫脹，折光性差，有大量的細(xì)胞碎屑，并出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞。缺氧共培養(yǎng)組NSCs形態(tài)有所改善，細(xì)胞折光性仍較好，大部分細(xì)胞突起仍未見回縮，僅少數(shù)NSCs腫脹，壞死。 3、缺氧時(shí)間與新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞活性的關(guān)系：分別缺氧培養(yǎng)2h、4

5、h、8h和28h后復(fù)氧培養(yǎng)48h，NSCs隨著缺氧時(shí)間的延長，細(xì)胞死亡明顯增多，NSCs存活率明顯下降；缺氧共培養(yǎng)組的NSCs形念有所改善，細(xì)胞折光性仍較好，大部分 NSCs突起仍未見回縮，僅少數(shù)細(xì)胞腫脹，共培養(yǎng)組NSCs存活率高于單純?nèi)毖鮊SCs組(P<0.05)。 4、缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響：腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化數(shù)目與單純?nèi)毖跎窠?jīng)細(xì)胞分化相比，明顯增多，但對分