肛門直腸畸形直腸末端腸神經(jīng)系統(tǒng)的改變及其與Shh-BMP4信號的關系.pdf

1、目的：
　　 1、通過檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)及骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）在直腸末端腸壁的表達情況，研究不同類型先天性肛門直腸畸形(anorectal malformation，ARM)胎鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)的發(fā)育程度，探討ARM患兒術后排便功能障礙的機制。
　　

2、 2、通過檢測Shh/BMP4信號在直腸末端的表達水平，探索正常及ARM胎鼠ENS發(fā)育過程中可能涉及的分子調控機制。
　　 方法：
　　 1、ARM動物模型建立：將實驗動物隨機分為實驗組和對照組，應用全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)致畸，建立ARM胎鼠模型。在實驗組孕鼠(n=10)妊娠第10天時，將ATRA以40mg/mL濃度溶于橄欖油后，按100mg/kg一次性大劑量灌胃；對照組

3、孕鼠(n=6)給予等量橄欖油灌胃。
　　 2、NSE和BMP4的免疫組化染色：對照組和實驗組孕鼠，于孕20天時行剖宮術，胎仔置于4％多聚甲醛中固定過夜，以正中矢狀位劈開胎鼠，取其盆部常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，所得標本矢狀位連續(xù)切片，厚度為4μm，在顯微鏡下觀察未染色的石蠟切片，根據(jù)直腸閉鎖位置區(qū)分高低位，分別選取對照組、高位ARM組、低位ARM組胎鼠標本15例，取正中矢狀位切片進行免疫組化染色。
　　 3、RT-PCR實驗

4、：解剖顯微鏡下剖取直腸末端組織1cm，置于液氮中暫存。分別檢測12例高位ARM組、低位ARM組、對照組直腸末端Shh和BMP4基因的表達水平。
　　 結果：
　　 1、免疫組化染色：對照組腸壁肌間及黏膜下神經(jīng)叢可見NSE和BMP4抗體染色陽性細胞，ARM高位組分別與ARM低位組、對照組比較，陽性細胞的平均光密度值(meanoptical density，MOD)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；ARM低位組和

5、對照組相比，陽性細胞的MOD值略降低，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、半定量分析Shh、BMP4基因mRNA含量：在直腸末端Shh和BMP4基因表達呈顯著正相關關系(P＜0.01，r=0.884)，對照組分別與高、低位ARM組相比較，BMP4和Shh基因的表達水平明顯高于各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，不同畸形組之間比較，高位ARM組的表達水平顯著減弱，低于低位ARM組，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05