正常及先天性肛門直腸畸形大鼠及人類腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及調(diào)控的對(duì)比研究.pdf

1、先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations，ARMs)是小兒常見(jiàn)的消化道畸形，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一，占消化道畸形的1/4，發(fā)病率為1/5000～1/1500。盡管長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)肛門直腸畸形的手術(shù)方式進(jìn)行著不斷的改進(jìn)，但中、高位ARMs的術(shù)后長(zhǎng)期隨訪顯示，仍有許多患者存在不同程度的排便、控便功能障礙。術(shù)后肛門直腸功能障礙是盆底神經(jīng)肌肉發(fā)育不良所致，而腸道動(dòng)力無(wú)疑是影響直腸肛管控便屏障最重要的因素之一

2、，研究ARMs腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸道肌肉及神經(jīng)肌肉聯(lián)系的發(fā)育及其可能的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)很有必要。 既往研究顯示，在中、高位肛門直腸畸形患者中，其骶髓中樞及直腸末端的神經(jīng)系統(tǒng)有不同程度的改變，但迄今為止，對(duì)其胚胎發(fā)育過(guò)程和詳細(xì)的病理改變尚不清楚。 本文應(yīng)用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的Wistar大鼠的ARMs動(dòng)物模型，利用神經(jīng)元、突觸囊泡蛋白及氮能神經(jīng)元的發(fā)育作為評(píng)價(jià)腸神經(jīng)系統(tǒng)及腸道神經(jīng)肌肉發(fā)育的標(biāo)志物

3、，應(yīng)用相應(yīng)的抗體即蛋白基因產(chǎn)物(protein gene product9.5，PGP9.5)、突觸素(synaptophysin，SYP)及一氧化氮合成酶(nitric oxide synthases，Nos)觀察上述指標(biāo)在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及變化；同時(shí)分析Wnt5a及其受體Frizzled—1、TCF4蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠結(jié)腸的表達(dá)及變化情況，探討正常及ARMs大鼠與排便控制密切相關(guān)的腸神經(jīng)系統(tǒng)及腸道平滑肌的胚胎期發(fā)

4、育的可能調(diào)控機(jī)制。另外，我們采用ARMs患兒的直腸末端組織對(duì)Wnt5a的表達(dá)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，以期得到一些更為有益的研究啟示。 實(shí)驗(yàn)材料： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 體重250～300克的Wistar大白鼠，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物部提供。 2、病例標(biāo)本： ARMs患兒直腸末端標(biāo)本20例：男14例，女6例，平均年齡8.5個(gè)月；其中高位畸形5例，中位畸形7例，低位畸形8例。7例死于非胃腸道疾病患兒的直

5、腸末端標(biāo)本為對(duì)照組：男5例，女2例，平均年齡7.3個(gè)月。 3、實(shí)驗(yàn)試劑： ①PGP9.5單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)；②SYP單克隆抗體、Nos、Wnt5a、Frizzled—1和TCF4多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)；③免疫組化UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；二步法山羊免疫組化檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋公司)；④乙烯硫脲(Ethyleneth

6、iourea，ETU)(購(gòu)自德國(guó)Sigma—Aldrich公司)；⑤逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；⑥總蛋白抽提試劑盒(購(gòu)自賽馳公司)。 實(shí)驗(yàn)方法： 在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10)，按125mg/kg經(jīng)胃管給予孕鼠灌入ETU(濃度為1％，以生理鹽水做溶劑)，制作ARMs大鼠動(dòng)物模型；對(duì)照組給予等量的生理鹽水。分別在大鼠E15—E21時(shí)剖宮取胎，部分取完整胚胎或胚胎盆部，經(jīng)4％多聚甲醛磷酸鹽緩

7、沖液固定、脫水后制成蠟塊，行矢狀面、橫斷面的連續(xù)切片，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：①PGP9.5、SYP及Nos免疫組化/熒光染色，以其作為胚胎期ENS發(fā)育的標(biāo)志物，觀察正常和ARMs大鼠ENS的胚胎發(fā)育過(guò)程；②進(jìn)行Wnt5a、Frizzled—1、TCF4的免疫組化染色來(lái)大體比較上述因子在直腸壁內(nèi)的表達(dá)情況。另一部分鼠胚通過(guò)顯微鏡下取材獲得末端直腸標(biāo)本，部分進(jìn)行Wnt5a、Frizzled—1及TCF4 mRNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，其余部分標(biāo)本

8、進(jìn)行PGP9.5、SYP、Nos、Wnt5a、Frizzled—1及TCF4的western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白定量分析，G：BOXSYNGENE凝膠分析系統(tǒng)拍照，Kodark Digital Science1.0 DNA分析軟件進(jìn)行半定量分析。所有數(shù)據(jù)均以x()s表示，差異比較采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各胎齡正常組與ARMs組的t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 人類正常及ARMs直腸末端標(biāo)本進(jìn)行Wnt5a的免

9、疫組化及Western blot實(shí)驗(yàn)，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定位和定量，并比較分析。 結(jié)果： 1、正常與ARMs的直腸內(nèi)ENS的胚胎發(fā)育過(guò)程及比較 2、Wnt5a等發(fā)育相關(guān)因子在正常和ARMs大鼠直腸壁胚胎發(fā)育期的表達(dá)對(duì)比 3、Wnt5a在正常和ARMs人類直腸壁表達(dá)的對(duì)比結(jié)果 結(jié)論： 1、在正常及ARMs大鼠胚胎，在E16左右，神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移到直腸區(qū)域，但直腸末端神經(jīng)發(fā)育很差，隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育

10、，直腸區(qū)域的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育逐漸完善，逐漸形成神經(jīng)叢狀結(jié)構(gòu)，生后發(fā)育更加完善。ARMs大鼠胚胎的ENS在E16時(shí)，其形態(tài)與正常組無(wú)明顯差異，從E18起，可觀察到發(fā)育異常的ENS，隨著胎齡的加大，與正常相比，發(fā)育差異更加顯著。 2、氮能神經(jīng)元作為重要的神經(jīng)元亞型，其發(fā)育過(guò)程是伴隨神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移而發(fā)育的，但稍遲一些，推測(cè)NO可能在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中也起著重要作用，ARMs大鼠胚胎直腸末端區(qū)域的突觸素的發(fā)育較正常組差，可能也是導(dǎo)致腸

11、道動(dòng)力改變的一個(gè)原因。 3、E16～E21，Wnt5a及其受體Frizzled—1及Wnt經(jīng)典通路的關(guān)鍵因子TCF4在ARMs組的腸壁粘膜、肌層及腸神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)較正常組減弱，可能與ARMs直腸神經(jīng)系統(tǒng)及直腸末端壁平滑肌發(fā)育不良的調(diào)控相關(guān)。 4、Wnt5a主要表達(dá)在人類直腸壁肌間神經(jīng)叢部位，在肛門直腸畸形患者的直腸末端表達(dá)水平減低，推測(cè)Wnt5a在人類先天性肛門直腸畸形發(fā)生后的直腸神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步的發(fā)育中可能具有重要調(diào)節(jié)作