Cx43在MG53抑制缺血-再灌注心律失常中的作用研究.pdf

1、背景：
　　再灌注心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）是缺血/再灌注損傷(ischemiareperfusion，I/R)中的常見電生理現(xiàn)象，多發(fā)生在冠脈再通后較短時(shí)間內(nèi)。RA是主要表現(xiàn)為離子通道以及電傳導(dǎo)的異常。
　　RA的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，包括氧自由基增加、鈣超載、縫隙連接的重塑、折返激動(dòng)的產(chǎn)生、游離脂肪酸的增加等，眾多的發(fā)病機(jī)制均與細(xì)胞膜的完整性密切相關(guān)，有效保護(hù)細(xì)胞膜的完整性就可能減少RA的

2、發(fā)生。
　　MG53(Mitsugumin53)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)細(xì)胞膜有修復(fù)作用的肌特異性蛋白，其作用在骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中都得到了證實(shí)。研究者發(fā)現(xiàn)MG53蛋白在心臟I/R中發(fā)揮了重要保護(hù)作用。同時(shí)，缺血預(yù)適應(yīng)(ischemicpreconditioning，IPC)能夠使MG53表達(dá)量增加，并且有大量研究報(bào)道IPC能夠明顯降低RA的發(fā)生率及嚴(yán)重程度。
　　縫隙連接是RA的發(fā)生發(fā)展中的重要因素。生理狀態(tài)下

3、，Cx43以磷酸化形式表達(dá)于心肌閏盤處，與細(xì)胞縱軸垂直，其形成縫隙連接通道的數(shù)目、大小、特點(diǎn)及連接心肌細(xì)胞的形狀是正常心肌細(xì)胞傳導(dǎo)電沖動(dòng)的基礎(chǔ)。I/R過程中心肌縫隙連接蛋白的變化主要有:Cx43的側(cè)面化、去磷酸化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)的異向性以及除極復(fù)極時(shí)間不一致，從而引起心律失常的發(fā)生。
　　Cx43主要存在于細(xì)胞膜上，而MG53具有修復(fù)受損細(xì)胞膜的功能。鑒于PKCε信號(hào)通路可以使Cx43的磷酸化水平、分布維持穩(wěn)定，而MG53在I

4、/R中能夠激活PKCε信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用，提示PKC信號(hào)通路可能該參與了MG53抑制Cx43去磷酸化和重分布的過程。
　　基于上述研究結(jié)果，我們提出假設(shè):MG53作用于Cx43，增強(qiáng)PKCε與Cx43的共連接，抑制I/R過程中Cx43的重分布，增加Cx43的去磷酸化，從而發(fā)揮了對(duì)RA的保護(hù)作用。
　　目的：
　　(1)明確MG53對(duì)心臟RA的保護(hù)作用;
　　(2)探討Cx43在MG53對(duì)心臟RA保護(hù)作用中的機(jī)制

5、。
　　內(nèi)容：
　　(1)建立SD大鼠心臟Langendorff RA模型，觀察MG53對(duì)RA的影響。
　　(2)建立H9C2細(xì)胞H/R模型，觀察MG53對(duì)細(xì)胞活力的影響。
　　(3)觀察MG53預(yù)處理，在RA模型中，對(duì)Cx43磷酸化及分布的影響。
　　(4)確定MG53與Cx43是否存在共連接，以及MG53預(yù)處理對(duì)共連接的影響。
　　(5)明確Cx43與PKCε是否存在共連接，以及MG53預(yù)處理對(duì)共

6、連接的影響。
　　方法：
　　(1)采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)，建立RA模型給予MG53預(yù)處理，觀察心律失常的發(fā)生情況以及嚴(yán)重程度。
　　(2)MG53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)H9C2細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，免疫印跡法檢測(cè)其是否高表達(dá)MG53蛋白，建立細(xì)胞H/R模型，CCK-8法檢測(cè)MG53對(duì)H/R的保護(hù)作用。
　　(3)常規(guī)提取心肌蛋白，用免疫印跡法檢測(cè)其Cx43蛋白表達(dá)的變化。
　　(4)常規(guī)固定心臟組織

7、，石蠟切片，用免疫熒光法檢測(cè)Cx43分布的改變。
　　(5)常規(guī)提取心肌蛋白，免疫共沉淀法檢測(cè)MG53和Cx43是否存在共連接，以及MG53預(yù)處理后其共連接是否有改變。
　　(6)常規(guī)提取心肌蛋白，免疫共沉淀法檢測(cè)MG53預(yù)處理，對(duì)PKCε和Cx43共連接的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)缺血/再灌注損傷中， MG53預(yù)處理組能明顯降低再灌注心律失常評(píng)分，減少VT、VF等致死性心律失常的發(fā)生率，縮短VT、VF的持續(xù)

8、時(shí)間。
　　(2)MG53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，能顯著提高M(jìn)G53蛋白的表達(dá)水平，在H/R損傷中，能明顯提高細(xì)胞活力。
　　(3)缺血/再灌注損傷中， MG53預(yù)處理能夠使Cx43蛋白的磷酸化及分布維持在穩(wěn)定水平，抑制其重分布，增加其磷酸化。
　　(4)MG53與Cx43存在共連接，而缺血/再灌注損傷中， MG53預(yù)處理后，能增強(qiáng)其共連接。
　　(5)Cx43與PKCε存在共連接，缺血/再灌注損傷中， MG53預(yù)處理能夠增