CX32和CX43在癲癇幼鼠海馬區(qū)的表達及甘珀酸的干預作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是一種復雜的臨床綜合征，是由多種病因引起的，以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然的、反復的、短暫的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。它是嚴重危害人類健康的慢性疾病之一，給社會、家庭和個人帶來了難以估量的沉重的精神和經(jīng)濟負擔，因其較高的發(fā)病率和嚴重的危害性，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患中最受關注的一組疾病。近年來，癲癇的研究在許多方面已取得了很大進展，但就其發(fā)病機制仍不是十分清楚。
　　 縫隙連接(gapjun

2、ction GJ)為細胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，是相鄰細胞間唯一能直接進行能量、物質(zhì)和信息交換的特殊通道。信息離子，小分子物質(zhì)可經(jīng)過該通道進行細胞間轉(zhuǎn)運。縫隙連接在神經(jīng)元電活動的維持、神經(jīng)元快速同步化、神經(jīng)元的發(fā)育中發(fā)揮著十分重要的作用，同時還參與傳遞第二信使及整合膠質(zhì)細胞的活動。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)縫隙連接在癲癇形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用。連接蛋白32(connexin32 CX32)、連接蛋白43(connexin43CX43)

3、是組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞之間縫隙連接的主要蛋白。CX32、CX43與癲癇的關系也備受國內(nèi)外學者關注。
　　 甘珀酸為非選擇性縫隙連接阻斷劑，能通過衍生物直接與縫隙連接結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化，從而導致通道關閉。
　　 目的
　　 本研究在建立鋰.匹羅卡品癲癇幼鼠模型的基礎上，探討CX32和CX43與癲癇的關系及其在癲癇形成中的作用，縫隙連接阻斷劑甘珀酸可能具有潛在的抗癲癇作用。
　　 材料與方

4、法
　　 1.分組：21日齡健康SD大鼠120只，雌雄不限，體重(65-70)g，隨機分成為對照組(n=40)、模型組(n=40)、干預組(n=40)。
　　 2.行為學觀察：各組大鼠在藥物處理后，立即進行觀察，每天至少5個小時；凡連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級以上發(fā)作，為完全點燃。癇性發(fā)作強度參考Racine6級(0-V)評定法。
　　 3.標本采集與制備：每組分別于24小時、3天、7天、30天經(jīng)各取10只經(jīng)乙醚麻醉后，剪開

5、胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，以20ml注射器連接5號頭皮針經(jīng)左心室灌注9g/L鹽水和40g/L多聚甲醛，直至右心耳流出澄清液體、肝臟發(fā)白、軀干變硬為止。斷頭取腦，做冠狀切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色及連接蛋白CX32和CX43免疫組化檢測。
　　 4.指標測定
　　 1)由于鋰-匹羅卡品癲癇動物模型特點，行為學觀察分三個階段進行：
　　 急性期：重型發(fā)作的次數(shù)，潛伏期長度；
　　 靜止期：靜止期的長度

6、；
　　 自發(fā)性反復發(fā)作期(spontaneous recurrent seizures SRSs)：自發(fā)性反復發(fā)作的次數(shù)；
　　 2)HE染色：常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織病理改變。
　　 3)胞核染成棕黃色者判為CX32、CX43陽性表達產(chǎn)物，然后用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測量切片海馬CA1區(qū)CX32、CX43吸光度值(OD)，每張切片取5個視野測量取其平均值，同時測量同一張切片胼胝體的OD值以作為背景O

7、D值，用矯正吸光度值COD(實測值-背景值)進行比較和分析，以避免染色過程中非特異性染色所造成的誤差。
　　 5.統(tǒng)計學分析：各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，以α=0.05為檢驗水準。應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，兩兩比較采用t檢驗，成組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.行為學評估結(jié)果：模型組大鼠急性期重型發(fā)作(RacineⅣ-Ⅴ級)次數(shù)較干預組明顯增高(P<0.05)，且

8、其潛伏期明顯延長(P<0.05)；對照組無癇樣發(fā)作。
　　 2.海馬區(qū)HE染色：與對照組相比，模型組大鼠海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元大量脫失；與致癇組相比，干預組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元脫失不明顯，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。
　　 3.免疫組織化學染色：模型組各時間點大鼠海馬區(qū)CX32表達較同一時間點對照組明顯增高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；干預組各時間點海馬區(qū)CX32表達較同一時間點模型組降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學

9、意義；CX43在致癇組表達是持續(xù)增高，隨著時程延長陽性細胞表達增多，與對照組同一時間點比較(24h、3d、7d、30d、P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；干預組各時間點海馬區(qū)CX43表達較同一時間點模型組降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.CX32和CX43在癲樣放電后表達顯著增多，提示CX32、CX43在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要的意義。
　　 2.縫隙連接阻斷劑甘珀酸可能