VEGF跨血腦屏障“時(shí)間窗”在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型中的研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，觀察新生大鼠HIBD模型血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)穿透血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的時(shí)間，探討HIBD時(shí)BBB通透性改變的“時(shí)間窗”，為VEGF在HIBD中應(yīng)用提供最佳給藥方法和治療時(shí)間的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：

2、將VEGF經(jīng)二種途徑(骨髓腔、鼻腔)在不同時(shí)間點(diǎn)同時(shí)給予7日齡SD新生大鼠HIBD模型，同時(shí)設(shè)假手術(shù)組、HIBD組、HIBD骨髓腔注射VEGF組及HIBD鼻腔滴VEGF組，每組各48只。四組根據(jù)處死時(shí)間不同又分為6個(gè)亞組：2h組、6h組、12h組、24h組、48h組、72h組，每亞組各8只。HIBD模型采用阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈后置于含8％O292%N2混合氣體的低氧環(huán)境中2h制備而成。HIBD骨髓腔注射VEGF組及HIBD鼻腔滴VEGF組均

3、于處死前半小時(shí)給VEGF。在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)觀察各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為學(xué)變化、腦組織外觀、腦組織病理改變及ELISA法檢測(cè)腦組織勻漿中VEGF水平。
　　結(jié)果：（1）7日齡SD大鼠在HIBD后出現(xiàn)不同程度的行為異常。（2）假手術(shù)組腦組織在各時(shí)間點(diǎn)外觀正常，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)，無(wú)水腫、軟化及液化壞死灶。HIBD模型組在12h左側(cè)腦組織出現(xiàn)輕微水腫、體積增大；在24h左側(cè)腦組織水腫明顯，局部可呈蒼白色；在48h、72h左側(cè)腦組織水腫程度加重，局部可見(jiàn)軟化、

4、液化壞死灶。（3）HE染色：假手術(shù)組腦組織在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)構(gòu)層次清楚、細(xì)胞形態(tài)正常。HIBD組在12h左側(cè)腦組織可有細(xì)胞水腫；在24h、48h可見(jiàn)細(xì)胞不同程度的水腫、變性壞死、溶解、核固縮及核碎裂；72h細(xì)胞壞死更明顯。（4）這四組新生大鼠在2h、6h、12h、24h、48h、72h ELISA法檢測(cè)10%腦組織勻漿VEGF水平分別為，假手術(shù)組：119.7±12.6ng/L、117.6±12.4ng/L、120.9±12.1ng/L、124

5、.1±12.2ng/L、121.3±12.2ng/L、119.3±10.9ng/L，HIBD組：118.9±11.3ng/L、129.7±12.5ng/L、164.1±14.6ng/L、208.5±15.8ng/L、177.6±13.6ng/L、159.3±16.1ng/L，骨髓注射組：121.0±10.2ng/L、132.0±9.9ng/L、213.1±23.4ng/L、523.2±26.6ng/L、463.3±39.4ng/L、37

6、1.1±16.7ng/L，鼻腔組：224.5±19.1ng/L、231.9±20.0ng/L、237.6±21.4ng/L、231.3±19.3ng/L、218.6±29.6ng/L、227.9±22.1ng/L。這可觀察到：假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿中VEGF水平?jīng)]有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿中 VEGF水平是相對(duì)穩(wěn)定的。HIBD組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織勻漿中VEGF水平有明顯不同，差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；2h與6h之間VEGF水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；隨著HIBD后時(shí)間的延長(zhǎng)，在12h、24h、48h、72h VEGF水平均較2h、6h升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01），尤其在24h腦組織勻漿中VEGF水平較12h、48h、72h均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01），72h較48h明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明HIBD組腦組織勻漿中VEGF水平在2

8、h至6h沒(méi)有升高，在6h后至12h開(kāi)始升高，于24h達(dá)高峰，至48h開(kāi)始下降，于72h明顯下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HIBD組腦組織免疫組織化學(xué)染色在12h染色開(kāi)始明顯，24h染色達(dá)到高峰，至48h染色開(kāi)始下降，于72h染色明顯下降，這與ELISA法檢測(cè)腦組織勻漿中VEGF水平變化相一致。骨髓注射組在不同時(shí)間點(diǎn)間腦組織勻漿中 VEGF水平有明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而2h與6h之間VEGF水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.

9、05），但在12h、24h、48h、72h VEGF水平均較2h、6h升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01），尤其在24h腦組織勻漿中VEGF水平均較12h、48h、72h明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01），72h較48h明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平在12h開(kāi)始升高，于24h達(dá)高峰，至48h開(kāi)始下降，于72h明顯下降，且在此時(shí)間段VEGF水平明顯高于HIBD組，這提示

10、HIBD12h后VEGF可以跨過(guò)BBB，即HIBD后12h BBB通透性明顯增加，在24h通透性最高，于48h通透性開(kāi)始降低，至72h通透性明顯降低。鼻腔組在不同時(shí)間點(diǎn)間腦組織勻漿中VEGF水平?jīng)]有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明鼻腔組在不同時(shí)間點(diǎn)間腦組織勻漿中VEGF水平是相對(duì)穩(wěn)定的。
　　在相同時(shí)間點(diǎn)不同組別間的比較：在2h、6h時(shí)間點(diǎn)均可觀察到假手術(shù)組、HIBD組、骨髓注射組各組間腦組織勻漿中VEGF水平均沒(méi)

11、有明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa>0.05）；鼻腔組較假手術(shù)組、HIBD組、骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01）。這提示在HIBD后2h、6h骨髓途徑給予VEGF均不能進(jìn)入腦組織，且腦組織缺氧缺血2h、6h沒(méi)有影響腦組織VEGF水平，但鼻腔途徑給予VEGF均可以相對(duì)穩(wěn)定的水平進(jìn)入腦組織。在12h、24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)均可觀察到HIBD組、骨髓注射組、鼻腔組腦組織勻漿中VEGF水平

12、均較假手術(shù)組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01）；骨髓注射組、鼻腔組腦組織勻漿中VEGF水平均較HIBD組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01）。在24h、48h、72h時(shí)間點(diǎn)均可觀察到骨髓注射組腦組織勻漿中VEGF水平均較鼻腔組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pa<0.01）。這些提示腦組織缺氧缺血12h、24h、48h、72h可以使腦組織VEGF表達(dá)水平升高；在HIBD后12h、24h、48h、72h骨髓途徑給予VE

13、GF均可不同程度地進(jìn)入腦組織，尤其在HIBD后24h、48h為最明顯，但于72h開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，即說(shuō)明HIBD后12h BBB通透性明顯增加，在24h通透性最高，于48h通透性開(kāi)始下降，至72h通透性明顯降低。鼻腔組在不同時(shí)間點(diǎn)間腦組織勻漿中 VEGF水平是相對(duì)穩(wěn)定的，且在各時(shí)間點(diǎn)VEGF水平都明顯高于HIBD組，這說(shuō)明在HIBD后各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)鼻腔途徑給予VEGF均可以相對(duì)穩(wěn)定的水平進(jìn)入腦組織，并說(shuō)明本組腦組織中VEGF水平與HIBD無(wú)關(guān)

14、，即與BBB通透性改變無(wú)關(guān)，提示鼻腔途徑給VEGF不是經(jīng)過(guò)BBB進(jìn)入腦組織，而可能是經(jīng)其它途徑，如嗅覺(jué)通路和三叉神經(jīng)通路進(jìn)入腦組織。
　　結(jié)論：7日齡SD大鼠HIBD后，其腦組織VEGF表達(dá)在12h開(kāi)始升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，于24h達(dá)高峰，至48h開(kāi)始下降，于72h明顯下降；在HIBD后2h、6h、12h、24h、48h、72h鼻腔途徑給予VEGF均可以相對(duì)穩(wěn)定的水平進(jìn)入腦組織，即提示鼻腔途徑給VEGF不是經(jīng)過(guò)BBB進(jìn)入腦組織，而