轉(zhuǎn)染P21基因抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討外源性P21基因轉(zhuǎn)染對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(humanretinalpigmentepithelial，hRPE)細(xì)胞增殖的抑制作用及作用機(jī)制，為治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)提供新的基因治療思路。 方法:(1)以含有P21全長序列的質(zhì)粒pCEP-P21為模板PCR擴(kuò)增P21cDNA，應(yīng)用基因重組技術(shù)與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合，構(gòu)建以GFP為報(bào)告基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-P21，酶切及序列測定檢測

2、插入片段的正確性。(2)hRPE細(xì)胞原代和傳達(dá)培養(yǎng)，傳至第三代時(shí)，通過細(xì)胞爬片，應(yīng)用抗人細(xì)胞角蛋白染色的免疫組織化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。(3)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將含GFP的重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-P21轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的hPRE細(xì)胞。以轉(zhuǎn)染相同劑量空載體pEGFP-C1的孔為轉(zhuǎn)染對(duì)照組，以未作轉(zhuǎn)染的hRPE細(xì)胞為非轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。(4)在活細(xì)胞狀態(tài)下用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-P21融合蛋白在細(xì)胞中的分布和定位，并檢測其在轉(zhuǎn)染后6、12、2

3、4、48、72h的轉(zhuǎn)染效率；用Westernblot方法分析P21蛋白的表達(dá)。(5)轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)用RT-PCR檢測各組RbmRNA的表達(dá)；Westernblot方法分析Rb蛋白的表達(dá)水平，并分析Rb蛋白的磷酸化情況。(6)免疫組化檢測轉(zhuǎn)染后72h各組PCNA(proliferatingcellnuclearantigen，增殖細(xì)胞核抗原)的表達(dá)情況；流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期；細(xì)胞生長曲線、MTT法來檢測轉(zhuǎn)染后hRPE細(xì)胞的增生活性。

4、 結(jié)果:(1)酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)2條帶，大小分別為500bp和5Kb，與理論預(yù)計(jì)相符；重組質(zhì)粒中P21目的基因片段DNA序列及讀碼框架完全正確。酶切、DNA測序均證實(shí)插入片斷的正確性。(2)抗人細(xì)胞角蛋白染色的陽性率幾乎達(dá)100％，成功地在體外原代及傳代培養(yǎng)了hRPE細(xì)胞。(3)熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1對(duì)照組中，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光呈彌散分布；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-P21組中，綠色熒光在細(xì)胞胞漿胞

5、核內(nèi)都有表達(dá)，胞核內(nèi)表達(dá)明顯，呈強(qiáng)熒光顯示，與P21基因的表達(dá)一致；pEGFP-P21在轉(zhuǎn)染后6、12、24、48、72h的轉(zhuǎn)染率分別為3.65±0.88％、11.54±1.26％、26.27±1.39％、40.3±2.63％、32.9±1.86％。(4)Westemblot進(jìn)一步證實(shí)了pEGFP-P21融合基因的表達(dá)：融合蛋白在50KD處出現(xiàn)陽性條帶，轉(zhuǎn)染對(duì)照組的GFP蛋白于29KD處出現(xiàn)陽性條帶，而空白對(duì)照組未出現(xiàn)特異條帶。(5)活

6、細(xì)胞計(jì)數(shù)生長曲線及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，hRPE細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pEGFP-P21后其增殖活性降低(P＜0.01)，生長曲線平緩；而轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。P21高表達(dá)明顯抑制hRPE細(xì)胞生長，于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6d生長抑制率分別為14.3％、27.3％、33.3％、43.5％、45.1％和42.3％，且第5天抑制率最高。(6)細(xì)胞周期分析顯示，P21基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)后G1期和G0

7、細(xì)胞由49.65％增至78.63％，S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞分別由33.64％減少至11.01％，16.53％減少至10.29％，表現(xiàn)為明顯的G0/G1期阻滯，差異有顯著性(P＜0.01)，但未見明顯的促調(diào)亡作用；轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1組與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(7)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，Westernblot檢測到各組都出現(xiàn)2條蛋白帶，1條代表高磷酸化Rb蛋白(115KD)，另1條分子量較小的條帶為去磷酸化

8、Rb蛋白(105KD)?？瞻讓?duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞的Rb蛋白主要以磷酸化形式存在，呈高度磷酸化狀態(tài)(去磷酸化為20％)，二者無顯著差異(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組的hRPE細(xì)胞所表達(dá)的Rb蛋白主要是去磷酸化Rb蛋白。同兩組對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組的去磷酸化比例增加為60％，磷酸化的Rb減少。(8)RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-P21組RbmRNA表達(dá)量低于兩組對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)論: