人類防御素的重組表達(dá)與眼表水平表達(dá).pdf

1、目的：本研究以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ),摸索一種高量表達(dá)α防御素的有效方法.通過體內(nèi)外殺菌實(shí)驗(yàn),觀察人類α防御素3(human αdefensin-3,HD-3)的殺菌效果.檢測人類β防御素(human β defensins,ItBDs)在眼表組織中的分布,分析其在眼表疾病中的可能作用. 方法：1.將人α防御素3前體序列克隆到pDEST17表達(dá)載體的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),經(jīng)變性純化和稀釋

2、透析復(fù)性,產(chǎn)物以Bradford標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量. 2.采用克隆計數(shù)法鑒定αdefensin-3前體蛋白在體外對于各類細(xì)菌的殺菌效果和與抗生素的協(xié)同作用.此外,進(jìn)行初步眼表殺菌實(shí)驗(yàn),觀察小樣本范圍對眼表感染性炎癥的控制作用. 3.分別采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法分析人β防御素在人正常與炎性眼表組織中的表達(dá)與定位. 結(jié)果：1.在1升LB培養(yǎng)基可以純化到約12mg的人α防御素3前體蛋白,復(fù)性后,蛋白產(chǎn)量為1-3mg

3、,復(fù)性效率為15～20﹪.SDS-PAGE蛋白電泳顯示帶有His6標(biāo)簽的產(chǎn)物分子量約為10kD. 2.大腸桿菌DH5α、克雷伯菌和假單胞桿菌的LD50和LD99分別為10和45μg/ml,5和35μg/ml以及25和84μg/ml.而表皮葡萄球菌的LD50和LD99均大于120μg/ml.10ug/ml人α防御素3前體蛋白和10ug/ml鏈霉素聯(lián)合應(yīng)用后,大腸桿菌存活率降低至8﹪.使用重組人Q防御素3前體蛋白液1周后,結(jié)膜囊分泌

4、物消失,結(jié)膜充血明顯改善,角膜仍有一定程度水腫.炎癥與對照組比較有好轉(zhuǎn). 3.RT-PCR 發(fā)現(xiàn)HBD-1和HBD-3在所有被檢角結(jié)膜組織中均顯示陽性,HBD-2只在某些被檢組織中表達(dá)陽性,炎癥眼表組織和正常眼表組織之間存在明顯的表達(dá)差異.免疫組織化學(xué)法也顯示了相似的結(jié)果. 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)采用的蛋白表達(dá)策略是一種廉價、高效、操作簡便且表達(dá)量較高的生產(chǎn)α防御素切實(shí)可行的方法.為這一類蛋白的生物合成做了方法學(xué)上的有益補(bǔ)充.