豬β-防御素-2的重組表達及體外抑菌和抗病毒試驗研究.pdf

1、哺乳動物防御素是動物機體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一類重要的抗菌肽物質(zhì)，具有十分廣泛的抗菌譜，在先天免疫上起重要作用。本研究參照Veldhuizen等（2008）人工合成的pBD-2氨基酸序列重組表達了含有37個氨基酸的豬β-防御素-2（37）（pBD-2（37））和參照pBD-2的直系同源基因hBD-1的成熟肽序列重組表達了含有36個氨基酸的豬β-防御素-2（36）（pBD-2（36））。然后，在體外研究了pBD-2（36

2、）和pBD-2（37）的抑菌活性以及pBD-2（37）的溶血活性和抗病毒活性。
　　 1．豬β-防御素-2（pBD-2）的重組表達及純化
　　 1.1 pBD-2（37）的重組表達及純化
　　 根據(jù)已報道的pBD-2基因的cDNA序列，參照Veldhuizen等（2008）人工合成的pBD-2序列，合成了三條基因片段（1，2，3）。片段1、2和片段2、3各有15個堿基互補配對，PCR擴增延伸得到pBD-2（37）

3、基因，將pBD-2（37）基因重組于原核表達載體pGEX-KG，使其在大腸桿菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式表達。表達純化后的pBD-2（37）融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后，過Sephadex G-25柱層析，SDS-PAGE分析，獲得約3.8 kDa的目的蛋白pBD-2（37）。
　　 1.2 pBD-2（36）的重組表達及純化
　　 根據(jù)已報道的pBD-2基因的cDNA序列，參照pBD-2的直系同源基因hBD-1的成熟

4、肽序列，合成了三條基因片段（1，2，3'）。片段3'比片段3少三個堿基（gcg），片段1、2和片段2、3'各有15個堿基互補配對，PCR擴增延伸得到pBD-2（36）基因，將pBD-2（36）基因重組于原核表達載體pGEX-KG，使其在大腸桿菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式表達。表達純化后的pBD-2（36）融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后，過Sephadex G-25柱層析，SDS-PAGE分析，獲得約3.8 kDa的目的蛋白pBD-2（3

5、6）。
　　 2．pBD-2（37）的溶血活性和抗病毒活性研究
　　 將13.0μg/mL、26.0μg/mL和52.0μg/mL的pBD-2（37）與豬紅細(xì)胞作用1 h后，在450 nm下，測定吸光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS（pH=7.2）對照相比，13.0μg/mL、26.0μg/mL和52.0μg/mL的pBD-2（37）對豬紅細(xì)胞均有溶血活性，26.0μg/mLpBD-2（37）比13.0μg/mL pBD-2（37

6、）溶血現(xiàn)象明顯（P<0.001），26.0μg/mL pBD-2（37）和52.0μg/mL pBD-2（37）的溶血活性差異不顯著（P>0.05）?？共《驹囼灲Y(jié)果表明，pBD-2（37）（52.0μg/mL）對有囊膜的豬偽狂犬病毒（PRY）沒有抑制效果。
　　 3．pBD-2（37）和pBD-2（36）的抗菌活性研究
　　 調(diào)整瓊脂內(nèi)的細(xì)菌終濃度為106 CFU/mL，在瓊脂板上打直徑為約5mm的圓孔，加入0.1 mL