團(tuán)頭魴兩種肝臟表達(dá)抗菌肽和β防御素基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、肝臟表達(dá)抗菌肽1（liver-expressed antinicrobial peptide1，LEAP-1）、肝臟表達(dá)抗菌肽2(LEAP-2)和β防御素(β-defensin)是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，廣泛存在于魚類中，是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要成分，在抵御病原微生物入侵的過程中發(fā)揮著重要作用。LEAP-1在體內(nèi)外具有抑制細(xì)菌、真菌、病毒和原生動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，在機(jī)體鐵平衡的調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用。LEAP-2作為另外一種重要的

2、抗菌肽，具有抗菌作用。β-defensin除了能直接殺死細(xì)菌和病毒外，還可以間接促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的補(bǔ)充，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合和血管生成。
　　 團(tuán)頭魴是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。為了闡明LEAP-1、LEAP-2和β-defensin在團(tuán)頭魴早期發(fā)育階段以及細(xì)菌免疫應(yīng)答中的作用，為后續(xù)研究3種抗菌肽在其先天免疫系統(tǒng)中的生物活性奠定理論基礎(chǔ)，本研究通過分子克隆技術(shù)獲得團(tuán)頭魴LEAP-1、LEAP-2基因全長(zhǎng)

3、cDNA序列以及β-defensin基因部分cDNA序列，構(gòu)建3種基因的時(shí)空表達(dá)譜，并對(duì)免疫注射細(xì)菌后3種抗菌肽基因在團(tuán)頭魴組織中的表達(dá)變化進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.團(tuán)頭魴LEAP-1和LEAP-2基因分子克隆與表達(dá)分析
　　 團(tuán)頭魴LEAP-1基因cDNA(GeneBank accession no.JQ308841)全長(zhǎng)779 bp，其中開放閱讀框285 bp，5'端非編碼區(qū)115bp，3'端非編碼區(qū)

4、379 bp。開放閱讀框編碼94個(gè)氨基酸的前體肽，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，45個(gè)氨基酸的前結(jié)構(gòu)域和25個(gè)氨基酸的成熟肽。對(duì)團(tuán)頭魴LEAP-1氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明團(tuán)頭魴LEAP-1氨基酸序列與草魚、鳙的相似性最高，達(dá)到95％。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，在胚胎發(fā)育階段，LEAP-1基因mRNA表達(dá)量在囊胚中期下降，在眼囊出現(xiàn)期顯著增加到最大值，在尾鰭出現(xiàn)期迅速下降到中等水平。出膜后，LEAP-1基因mRNA表達(dá)量在出膜后第1和

5、3d逐漸增加到中等水平，在出膜后第7d降到低水平。在團(tuán)頭魴成魚組織中，LEAP-1基因mRNA在肝臟中表達(dá)量最高。細(xì)菌免疫后，團(tuán)頭魴肝臟中LEAP-1基因mRNA表達(dá)量逐漸增加并在注射后144h達(dá)到最高(P＞0.05)。腦組織中表達(dá)量在注射后72 h達(dá)到最大（P＞0.05）。在脾臟和鰓中表達(dá)量分別在注射后24h、6h顯著上升(P＜0.05)。
　　 團(tuán)頭魴LEAP-2基因cDNA(GeneBank accession no.JQ

6、344324)全長(zhǎng)564 bp，其中開放閱讀框279 bp，5'端非編碼區(qū)35bp，3'端非編碼區(qū)250 bp。開放閱讀框編碼92個(gè)氨基酸的前體肽，包括26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，25個(gè)氨基酸的前結(jié)構(gòu)域和41個(gè)氨基酸的成熟肽。對(duì)團(tuán)頭魴LEAP-2氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明團(tuán)頭魴LEAP-2氨基酸序列與草魚、斑馬魚的相似性最高，分別達(dá)到95％、84％。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，在胚胎發(fā)育階段，LEAP-2基因mRNA表達(dá)水平在原腸胚中期顯

7、著增加到最大值，隨后急劇下降到較低水平并保持到心跳期。在出膜前期表達(dá)量顯著增加并在剛出膜階段達(dá)到第二個(gè)峰值。出膜后，LEAP-2基因mRNA表達(dá)量在出膜后第3d顯著下降到較低水平，并上下波動(dòng)一直持續(xù)到出膜后第31 d。在成魚組織中，LEAP-2基因mRNA在中腸表達(dá)量最高。注射細(xì)菌后，肝臟中LEAP-2基因mRNA表達(dá)水平在注射后72 h和144h顯著上調(diào)（P＜0.05）。在脾臟、腦和鰓中，LEAP-2基因mRNA表達(dá)量分別在注射后6h

8、、24 h和6h出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.團(tuán)頭魴β-defensin1和β-defensin2基因分子克隆與表達(dá)分析
　　 團(tuán)頭魴β-defensin1、β-defensin2基因(maBD-1，maBD-2)部分cDNA序列分別長(zhǎng)201 bp和207 bp。maBD-1、maBD-2的登錄號(hào)分別為KC351182和KC412160。對(duì)團(tuán)頭魴maBD-1、maBD-2前體肽氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表

9、明maBD-1氨基酸序列與鯉、斑馬魚的相似性最高，分別達(dá)到98％、97％。maBD-2氨基酸序列與鯉、斑馬魚相似性最高，分別達(dá)到90％、87％。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育階段，maBD-1基因mRNA表達(dá)量在心臟出現(xiàn)期之前保持較低水平，在心跳期增加到中等水平。出膜后，maBD-1基因mRNA表達(dá)量在出膜后第1d顯著增加到最高值，在出膜第3d后下降到中等表達(dá)水平，并進(jìn)一步降到較低水平。maBD-2基因mRNA表達(dá)量在受精卵中最高，