大鼠β-防御素-2的重組表達及抗菌活性檢測.pdf

1、感染性疾病從古至今都是醫(yī)學(xué)研究中極為重要的課題。雖然抗生素在防治微生物感染中發(fā)揮了巨大的作用，但由于長期濫用抗菌藥物，細菌耐藥性問題已經(jīng)成為困擾醫(yī)學(xué)界的一大難題，解決細菌耐藥性問題成為當(dāng)務(wù)之急，因此，尋找和開發(fā)無耐藥性的新型抗菌藥物具有非常重要的現(xiàn)實意義?？咕淖鳛樯餀C體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，并且由于它獨特的抗菌機制使得病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性。因此，具有作為新型抗生素的潛在

2、應(yīng)用前景。
　　 目的：構(gòu)建大鼠β-防御素-2(rBD2)的真核表達載體pCAGG-rBD2，轉(zhuǎn)染小鼠纖維母細胞(L929)，檢測目的基因在轉(zhuǎn)染細胞中的表達，初步測定表達產(chǎn)物的體外抗菌活性，為解決細菌耐藥性問題提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：以大鼠肺組織總RNA為模板，采用RT-PCR的方法獲得β-防御素-2基因cDNA，將其克隆到pGEM-T Easy載體并構(gòu)建含有目的片段的真核表達載體pCAGG-rBD2，經(jīng)脂質(zhì)體

3、介導(dǎo)轉(zhuǎn)染L929細胞，用RT-PCR和Western blotting等方法檢測目的基因表達情況；用Kirby-Baue紙片擴散法檢測其生物學(xué)活性。
　　 結(jié)果：RT-PCR擴增出約230bp的片段，將其連接到克隆載體后，測序分析表明與Genebank中rBD2cDNA序列一致，為rBD2編碼全序列；所構(gòu)建的真核表達載體pCAGG-rBD2經(jīng)酶切鑒定并測序，結(jié)果表明其核苷酸序列及連接方向正確，可進行轉(zhuǎn)染；以轉(zhuǎn)染pCAGG-rBD

4、2的L929細胞總RNA為模板，用RT-PCR擴增出特異條帶；Western blotting檢測轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)液呈陽性，表明構(gòu)建的真核表達載體pCAGG-rBD2轉(zhuǎn)染L929細胞后，能正確表達大鼠β-防御素-2；K-B紙片法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pCAGG-rBD2細胞的培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌具有殺滅作用。
　　 結(jié)論：獲取并克隆了rBD2基因，成功構(gòu)建了rBD2的真核表達載體pCAGG-rBD2，轉(zhuǎn)染pCAGG-rBD2的L929

5、細胞能高效表達rBD2，轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)液具有殺滅金黃色葡萄球菌的生物活性。
　　 黃芪誘導(dǎo)大鼠氣管β-防御素-2的表達及抗感染機理的探討
　　 目的：通過黃芪等中藥成分誘導(dǎo)大鼠氣管β-防御素-2基因表達，探討黃芪防治呼吸道感染的作用機理。
　　 方法：將健康的Wistar大鼠隨機分成三組：空白對照組、黃芪組、雙黃連組，分別給予灌胃，于第五日按照RNA提取試劑盒提取氣管總RNA，并且運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-