抗B型肉毒毒素鼠源中和抗體快速制備及其免疫學(xué)活性的初步研究.pdf

1、肉毒毒素是肉毒梭狀桿菌產(chǎn)生的外毒素，屬神經(jīng)強(qiáng)毒，人類(lèi)的肉毒中毒主是由A,B和E引起。是目前已知毒性最強(qiáng)的細(xì)菌蛋白質(zhì)之一，是重要的生物戰(zhàn)劑。本論文以定向免疫和噬菌體展示技術(shù)為平臺(tái)，探索了一種快速制備及篩選鼠源抗體的技術(shù)路線(xiàn)，將篩選到的高親和力抗體直接進(jìn)行中和活性實(shí)驗(yàn)，將抗體基因克隆、高親和力抗體富集和抗體篩選在噬菌體水平一步完成，簡(jiǎn)便快速，研究周期短。為生物毒素新型抗毒素的制備提供新的研究思路。 本研究中首先克隆了B型肉毒毒素重鏈

2、C端基因，與已知序列同源性達(dá)99％。為了獲得重組蛋白，構(gòu)建了pET22重組質(zhì)粒載體，誘導(dǎo)表達(dá)后未得到目的蛋白。隨后構(gòu)建pET32重組質(zhì)粒，獲得了BoNTB/Hc的融合蛋白。對(duì)引物進(jìn)行改構(gòu)后，最終獲得了以包含體形式存在的BoNTB/HcN端修飾蛋白，并用金屬螯和層析法進(jìn)行了初步純化和鑒定。進(jìn)一步對(duì)其免疫學(xué)活性進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明重鏈Hc免疫后的BALB/c小鼠可以在一定程度上抵抗6×103LD50B型肉毒毒素攻擊，為B型肉毒毒素疫苗的研

3、究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)制備了卵黃檢測(cè)抗體(IgY)，抗體效價(jià)達(dá)104以上。 用重組表達(dá)并純化的BoNTB/Hc免疫小鼠，從其脾淋巴細(xì)胞中提取全套抗體可變區(qū)基因，分別構(gòu)建scFv和Fab段噬菌體抗體文庫(kù)，庫(kù)容分別為6.72×107cfu和5.69×106cfu。以純化的BoNTB/Hc為抗原，對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，并以BoNT/B為抗原進(jìn)一步鑒定特異性抗體，最終獲得與BoNT/B結(jié)合能力較強(qiáng)的scFv抗體2個(gè)，分別命名為S3和S24，

4、VH屬于VH2家族，Vκ分別屬于Vk2和Vκ1家族。Fab抗體1個(gè)，命名為F38，VH屬于VH1家族，Vκ屬于Vκ2家族。 重組抗體免疫學(xué)保護(hù)試驗(yàn)表明，抗B型肉毒毒素的噬菌體抗體S3對(duì)BoNT/B致死作用的保護(hù)性較強(qiáng)，能夠在一定程度上抵抗10LD50(i.p.)的致死作用，S24次之，F(xiàn)38較弱。未觀測(cè)到S3，S24和F38三者的明顯疊加作用。挑選作用較強(qiáng)的S3，進(jìn)行了體外重組制備，Westernblot鑒定初步純化的scFv抗