喹乙醇單克隆抗體的制備及其免疫學快速檢測方法的建立.pdf

1、喹乙醇(Olaquindox，OLA)是化學合成的喹噁啉類廣譜抗菌藥物，具有蛋白同化作用，可提高飼料轉(zhuǎn)化率與瘦肉率，促進動物生長，也可用于預防和治療細菌感染性疾病。但是在生產(chǎn)實踐中，喹乙醇的不規(guī)范使用不僅直接危害動物機體的健康，還可以通過食物鏈對人類健康造成極大的危害。隨著科學技術(shù)的發(fā)展和國家的重視，其檢測方法也不斷發(fā)展。目前已有電化學分析法、光譜法、色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、免疫分析技術(shù)等檢測方法。為了建立快速、靈敏的喹乙醇殘留

2、免疫學分析方法，本研究在分析喹乙醇免疫學特性的基礎(chǔ)上，運用單克隆抗體技術(shù)制備了喹乙醇單克隆抗體，并組裝了間接競爭ELISA試劑盒。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．喹乙醇人工抗原的制備與鑒定
　　 琥珀酸酐法合成衍生物喹乙醇-半琥珀酸酯(OLA-HS)；活化酯法合成全抗原OLA-BSA、OLA-OVA，紫外分光光度法(UV)、凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定；用OLA-BSA免疫BALB/c小鼠，間接ELISA測定多抗血清效

3、價，間接競爭ELISA鑒定其敏感性、特異性。紫外掃描圖譜顯示合成的人工抗原的最大吸收峰發(fā)生偏移，證明偶聯(lián)成功，并測得OLA-BSA、OLA-OVA中OLA-HS和BSA、OVA的分子結(jié)合比分別為分別為17.1:1和12.4:1；SDS-PAGE結(jié)果表明BSA的泳動速度大于OLA-BSA，說明OLA-BSA的分子量大于BSA，進一步說明OLA-HS與BSA偶聯(lián)成功。3[＃]小鼠抗血清的效價最高，對OLA的半數(shù)抑制濃度(IC50)為58.9

4、23 ng/mL，與卡巴氧的交叉反應(yīng)率為1.841[％]，與其他藥物無交叉反應(yīng)。通過實驗獲得了高價、敏感、特異的多克隆抗體(pAb)。
　　 2．喹乙醇單克隆抗體的制備及免疫學特性的鑒定
　　 間接ELISA和間接競爭ELISA選擇細胞融合備用鼠；雜交瘤技術(shù)制備喹乙醇單克隆抗體(OLAmAb)，并對其效價、親和力、敏感性、特異性、亞型進行鑒定；體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。篩選出了2B1、4F5、4E12、5B5、5

5、E5五株敏感特異的雜交瘤細胞；鑒定單抗亞型均為IgG1；細胞培養(yǎng)上清間接ELISA效價在1:3.0×102～1:1.28×103之間，4E12細胞株制作的腹水效價為1:5.12×105，OLAmAb親和常數(shù)Ka為3.75×1010L/moL，對OLA的IC50為1.66ng/mL；與卡巴氧的交叉反應(yīng)率為5.19[％]，與其它類藥物無交叉反應(yīng)。通過試驗獲得了高效價、敏感、特異的OLAmAb，可用于動物性食品中OLA的殘留檢測的免疫學試驗。

6、
　　 3．喹乙醇殘留免疫學快速檢測方法的建立
　　 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗原理，應(yīng)用OLAmAb研制出OLA殘留快速檢測間接競爭ELISA試劑盒(OLA-Kit)，OLA-Kit的標準曲線呈S型，符合4參數(shù)logit曲線擬合，最低檢測限為0.126μg/L，半數(shù)抑制濃度IC50為1.66ng/mL，平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于<15[％]。對豬肝、豬肉分別添加2、10、50、100ng/mL OLA標準品，平均回收率分別為