GABABR1和mGluR1在外傷性癲癇患者病灶中的表達(dá).pdf

1、1.研究目的：
　　 癲癇(epilepsy)是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病，具有突然發(fā)生、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。這些異常放電的神經(jīng)元群被稱為癲癇灶。外傷性癲癇(Post-traumatic epilepsy，PTE)是一種以反復(fù)癇樣發(fā)作為特征的疾病，是腦外傷后常見的繼發(fā)性疾病，系因各種暴力作用于顱腦，致腦實(shí)質(zhì)發(fā)生繼發(fā)性損傷，產(chǎn)生癲癇病灶，引起癲癇發(fā)作。
　　 癲癇的病因異常復(fù)雜

2、，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。但在神經(jīng)遞質(zhì)方面的研究較多，普遍認(rèn)為癲癇發(fā)作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)密切相關(guān)[5]，這些遞質(zhì)的失衡使神經(jīng)元異常放電，神經(jīng)元放電頻率過高并無限制地向周圍神經(jīng)元擴(kuò)散，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)為代表的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少與以谷氨酸(glutamic acid

3、，Glu)為代表的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增多是癲癇發(fā)生的主要機(jī)制之一，并且已得到證實(shí)。神經(jīng)遞質(zhì)要發(fā)揮效應(yīng)要通過相應(yīng)的受體來介導(dǎo)，因而目前國內(nèi)外的研究主要集中在其相應(yīng)受體的改變。國內(nèi)外已有GABAB受體和mGluR1在非外傷性癲癇動(dòng)物模型或患者中的表達(dá)變化研究，并已證實(shí)它們?cè)诜峭鈧园d癇發(fā)生發(fā)展中的作用；但尚未見到GABAB受體和mGluR1在人腦外傷性癲癇發(fā)病機(jī)制中所起作用的研究，它們?cè)谕鈧园d癇患者中是否也存在表達(dá)變化，以及表達(dá)的程度如何，是

4、本實(shí)驗(yàn)研究的內(nèi)容與目的。
　　 本研究以外傷性癲癇、非外傷性癲癇病人癲癇灶手術(shù)切除標(biāo)本及非癲癇組腦組織為研究對(duì)象，首先用光鏡(HE染色)觀察三組標(biāo)本在形態(tài)學(xué)上的差別，接著用免疫熒光技術(shù)觀察三組標(biāo)本間mGluR1、GABABR1的表達(dá)差異，再用RT-PCR技術(shù)檢測上述各組mGluR1、GABABR1在mRNA水平是否也存在表達(dá)差異，并最后以Western-blot技術(shù)對(duì)mGluR1、GABABR1在蛋白水平進(jìn)行定量檢測，本實(shí)驗(yàn)通過

5、上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)試圖闡明mGluR1、GABABR1在外傷性癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用，探索mGluR1和GABAB1R在外傷性癲癇中可能的臨床和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
　　 2.研究方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)共分為三組：外傷性癲癇組(腦外傷后繼發(fā)癲癇患者)15例、非外傷性癲癇組(原發(fā)性性癲癇患者)15例、非癲癇對(duì)照組(交通事故死亡者)15例。
　　 2.1對(duì)所收集的皮質(zhì)樣本均進(jìn)行HE染色，鏡下觀察各組標(biāo)本形態(tài)學(xué)改變；
　　

6、2.2運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從分子水平比較各實(shí)驗(yàn)組mGluR1和GABAB RlmRNA表達(dá)水平；
　　 2.3用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和熒光免疫組化染色技術(shù)從蛋白水平定性觀察各實(shí)驗(yàn)組mGluR1和GABAB R1對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)水平；
　　 2.4運(yùn)用western blot技術(shù)量化mGluR1和GABAB R1對(duì)應(yīng)的蛋白在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量，比較二者在外傷性癲癇組、非外傷性癲癇組和對(duì)照組中表達(dá)量的變化及差異。
　　

7、 3.研究結(jié)果：
　　 3.1HE染色觀察
　　 外傷性癲癇組和非外傷性癲癇組均存在神經(jīng)元數(shù)目減少，核固縮深染，突觸彎曲甚至呈螺旋狀，胞體縮小變形，細(xì)胞內(nèi)尼氏小體消失，胞漿變性、腫脹甚至呈空泡狀，染色呈深伊紅色，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，并可見嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象(神經(jīng)元被膠質(zhì)細(xì)胞圍繞吞噬)及膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)。
　　 非癲癇組沒有觀察到明顯的神經(jīng)元數(shù)目減少及膠質(zhì)細(xì)胞增生等現(xiàn)象，但可以觀察到部分神經(jīng)組織水腫。
　　 3.2熒

8、光免疫組化染色結(jié)果
　　 3.2.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1蛋白紅色熒光在外傷性癲癇組表達(dá)明顯高于非癲癇對(duì)照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABAB R1蛋白綠色熒光在外傷性癲癇組表達(dá)明顯低于非癲癇對(duì)照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.3 RT-PC

9、R結(jié)果
　　 3.3.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1 mRNA在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于非癲癇對(duì)照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.3.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABABR1 mRNA在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯低于非癲癇對(duì)照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4 western bl

10、ot結(jié)果
　　 3.4.1 mGluR1結(jié)果
　　 mGluR1蛋白在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯高于非癲癇對(duì)照組但低于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4.2 GABAB R1結(jié)果
　　 GABAB R1蛋白在外傷性癲癇組表達(dá)水平明顯低于非癲癇對(duì)照組但高于非外傷性癲癇組，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.研究結(jié)論：
　　 4.1

11、 HE染色結(jié)果分析顯示外傷性癲癇及非外傷性癲癇患者癲癇灶存在明顯的形態(tài)學(xué)改變，例如神經(jīng)元數(shù)目減少、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元變性、嗜神經(jīng)現(xiàn)象甚至膠質(zhì)小結(jié)的形成等，以上特征性改變?cè)诜前d癇組中十分少見。因此，可以將以上特征性改變綜合起來運(yùn)用到法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案之中，尤其是外傷性癲癇后經(jīng)手術(shù)治療的患者，本實(shí)驗(yàn)所顯示的形態(tài)學(xué)改變可為外傷性癲癇的法醫(yī)學(xué)鑒定提供一定的客觀證據(jù)。
　　 4.2外傷性癲癇與非癲癇對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在外傷性、非外傷

12、性癲癇灶中，GABABR1mRAN和蛋白存在低表達(dá)，mGluR1 mRAN和蛋白存在高表達(dá)，說明GABABR1、mGluR1參與外傷性、非外傷癲癇的發(fā)病過程，并且神經(jīng)遞質(zhì)及其受體的改變可能是導(dǎo)致外傷性癲癇發(fā)病原因之一。
　　 4.3非外傷性癲癇組與外傷性癲癇組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非外傷性癲癇病人中mGluR1和GABABR1的表達(dá)變化程度大于外傷性癲癇病人，說明外傷是促使外傷性癲癇發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。
　　 4.4本