黃芩及其提取物對甲型流感病毒核蛋白表達(dá)的體外實驗研究.pdf

1、目的：探討黃芩及黃芩提取成分對甲型流感病毒核蛋白基因(NP基因)表達(dá)的影響，和對核蛋白(NP)表達(dá)的影響，為尋找新的抗流感病毒中藥提供實驗依據(jù)。
　　 方法：本實驗首先采用細(xì)胞病變法(CPE)確定各種藥物的實驗濃度；然后將真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NP通過脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，將成功轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用膠體金免疫層析試紙法測NP蛋白的表達(dá)；取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取R

2、NA，合成cDNA，采用熒光定量RT-PCR法測NP基因的起始核酸量。本實驗設(shè)HeLa細(xì)胞組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+))、脂質(zhì)體組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NP)、黃芩水煎劑組、黃芩總黃酮組、黃芩苷組和黃芩素組，共八組。
　　 結(jié)果：采用細(xì)胞病變法得出各種藥物對HeLa細(xì)胞的無毒界限分別為：黃芩水煎劑：3906.25μg·ml-1，黃芩總黃酮：0.9765625μg·ml-1，黃芩苷：62.5

3、μg·ml-1，黃芩素：31.25μg·ml-1；藥物的實驗濃度分別為：黃芩水煎劑：1953.125μg·ml-1，黃芩總黃酮：0.48828125μg·ml-1，黃芩苷：31.25μg·ml-1，黃芩素：15.625μg·ml-1。轉(zhuǎn)染48h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用膠體金免疫層析試紙法測得NP蛋白表達(dá)：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、黃芩總黃酮組、黃芩苷組、黃芩素組為陽性，細(xì)胞對照組、脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和黃芩水煎劑組為陰性；從轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中提取

4、RNA，合成cDNA，并進(jìn)行熒光定量RT-PCR測試，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-3.455X+48.119；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出各組的NP基因起始核酸量分別為：細(xì)胞對照組：(0.6613±0.1020)×105copies.μ1-1，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組：(0.2520±0.0946)×105copies·μl-1，脂質(zhì)體組：(0.4750±0.1943)×105copies·μ1-1，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為(81.4500±29.6597)×105

5、 copies·μ1-1，黃芩水煎劑組：(29.6250±7.6596)×105copies·μl-1，黃芩總黃酮組：(61.0250±25.3261)×105copies·μl-1，黃芩苷組：(27.7250±12.8484)×105copies·μl-1，黃芩素組：(31.8250±8.2152)×105copies·μl-1。采用t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與細(xì)胞對照組比較，t=5.448，P=0.012<0.05，

6、具有統(tǒng)計學(xué)意義；與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，t=5.475，P=0.012<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與脂質(zhì)體組比較，t=5.460，P=0.012<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與黃芩水煎劑組比較，t=3.384，P=0.015<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與黃芩總黃酮組比較，t=1.047，P=0.335>0.05，不具有統(tǒng)計學(xué)意義；與黃芩苷組比較，t=3.324，P=0.016<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與黃芩素組比較，t=3.225，P=0.