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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:探討黃芩及黃芩提取成分對(duì)甲型流感病毒核蛋白基因(NP基因)表達(dá)的影響,和對(duì)核蛋白(NP)表達(dá)的影響,為尋找新的抗流感病毒中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:本實(shí)驗(yàn)首先采用細(xì)胞病變法(CPE)確定各種藥物的實(shí)驗(yàn)濃度;然后將真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NP通過脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,將成功轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞作為靶細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用膠體金免疫層析試紙法測(cè)NP蛋白的表達(dá);取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取R
2、NA,合成cDNA,采用熒光定量RT-PCR法測(cè)NP基因的起始核酸量。本實(shí)驗(yàn)設(shè)HeLa細(xì)胞組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+))、脂質(zhì)體組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NP)、黃芩水煎劑組、黃芩總黃酮組、黃芩苷組和黃芩素組,共八組。
結(jié)果:采用細(xì)胞病變法得出各種藥物對(duì)HeLa細(xì)胞的無毒界限分別為:黃芩水煎劑:3906.25μg·ml-1,黃芩總黃酮:0.9765625μg·ml-1,黃芩苷:62.5
3、μg·ml-1,黃芩素:31.25μg·ml-1;藥物的實(shí)驗(yàn)濃度分別為:黃芩水煎劑:1953.125μg·ml-1,黃芩總黃酮:0.48828125μg·ml-1,黃芩苷:31.25μg·ml-1,黃芩素:15.625μg·ml-1。轉(zhuǎn)染48h后,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用膠體金免疫層析試紙法測(cè)得NP蛋白表達(dá):重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、黃芩總黃酮組、黃芩苷組、黃芩素組為陽性,細(xì)胞對(duì)照組、脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和黃芩水煎劑組為陰性;從轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中提取
4、RNA,合成cDNA,并進(jìn)行熒光定量RT-PCR測(cè)試,得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=-3.455X+48.119;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各組的NP基因起始核酸量分別為:細(xì)胞對(duì)照組:(0.6613±0.1020)×105copies.μ1-1,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組:(0.2520±0.0946)×105copies·μl-1,脂質(zhì)體組:(0.4750±0.1943)×105copies·μ1-1,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為(81.4500±29.6597)×105
5、 copies·μ1-1,黃芩水煎劑組:(29.6250±7.6596)×105copies·μl-1,黃芩總黃酮組:(61.0250±25.3261)×105copies·μl-1,黃芩苷組:(27.7250±12.8484)×105copies·μl-1,黃芩素組:(31.8250±8.2152)×105copies·μl-1。采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與細(xì)胞對(duì)照組比較,t=5.448,P=0.012<0.05,
6、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,t=5.475,P=0.012<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與脂質(zhì)體組比較,t=5.460,P=0.012<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與黃芩水煎劑組比較,t=3.384,P=0.015<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與黃芩總黃酮組比較,t=1.047,P=0.335>0.05,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與黃芩苷組比較,t=3.324,P=0.016<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與黃芩素組比較,t=3.225,P=0.
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