黃芩苷聯(lián)合連翹苷對(duì)甲型流感病毒核蛋白基因表達(dá)影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　初步探討黃芩苷聯(lián)合連翹苷對(duì)甲型流感病毒核蛋白基因（NP基因）表達(dá)的影響，為尋找高效的抗流感病毒中藥復(fù)方提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用細(xì)胞病變法（CPE）測試藥物（黃芩苷、連翹苷）對(duì)Hela細(xì)胞的最大無毒濃度，確定各種藥物的實(shí)驗(yàn)濃度；
　　2.甲型流感病毒NP真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NP運(yùn)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)用靶細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPC

2、R）確定成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞；
　　3.反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）評(píng)價(jià)黃芩苷聯(lián)合連翹苷對(duì)靶細(xì)胞NP基因表達(dá)的影響，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)軟件進(jìn)行分析；
　　4.反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）評(píng)價(jià)不同濃度黃芩苷、連翹苷對(duì)靶細(xì)胞NP基因表達(dá)的抑制作用，并計(jì)算黃芩苷、連翹苷對(duì)靶細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）；
　　5.反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）評(píng)價(jià)IC25、IC50劑量的黃芩苷聯(lián)

3、合IC25、IC50、IC75劑量的連翹苷對(duì)靶細(xì)胞NP基因表達(dá)的聯(lián)合作用效果（協(xié)同、相加、拮抗）。
　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)Hela細(xì)胞組、脂質(zhì)體組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NP）、黃芩苷組、連翹苷組、黃芩苷聯(lián)合連翹苷組。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞病變法得出各種藥物的最大無毒濃度分別為：黃芩苷：31.25μg·ml-1，連翹苷：25μg·ml-1；實(shí)驗(yàn)濃度：黃芩苷：15.625μg·ml-1，連翹苷：12.5μ

4、g·ml-1；且黃芩苷（15.625μg·ml-1）聯(lián)合連翹苷（12.5μg·ml-1）顯示無毒。
　　2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組NP基因表達(dá)量明顯高于Hela細(xì)胞組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.742，P＜0.01）；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組NP基因表達(dá)量明顯高于脂質(zhì)體組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.802，P＜0.01）；說明流感病毒真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/NP成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。
　　3.黃芩苷（15.625μg·

5、ml-1）聯(lián)合連翹苷（12.5μg·ml-1）組NP基因表達(dá)量明顯低于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.966，P＜0.01）。
　　4.在一定濃度范圍內(nèi)，黃芩苷、連翹苷對(duì)靶細(xì)胞 NP基因表達(dá)有明顯的抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴性；黃芩苷、連翹苷對(duì)靶細(xì)胞NP基因表達(dá)的IC50分別為：10.4627μg·ml-1，4.16832μg·ml-1。
　　5.低濃度、中濃度黃芩苷（IC25、IC50）聯(lián)合低濃度、中濃

6、度、高連翹苷（IC25、IC50、IC75）對(duì)靶細(xì)胞NP基因表達(dá)的抑制作用CI值分別為：IC25黃芩苷+ IC25連翹苷：1.24169；IC25黃芩苷+ IC50連翹苷：0.95414；IC25黃芩苷+IC75連翹苷：0.94745；IC50黃芩苷+IC25連翹苷：0.89460；IC50黃芩苷+IC50連翹苷：0.85482；IC50黃芩苷+ IC75連翹苷：0.89201。低濃度黃芩苷聯(lián)合低濃度連翹苷起拮抗作用CI＞1；余濃度聯(lián)合