豬流行性腹瀉病毒N蛋白單克隆抗體的研制與抗原捕獲ELISA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一種由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)主要為嘔吐、水樣腹瀉和脫水等，對(duì)哺乳仔豬的危害最嚴(yán)重，致死率高。我國(guó)從1976年開(kāi)始有該病的報(bào)道，并且最近幾年流行的程度不斷加強(qiáng)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采用桿狀病毒和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建獲得PEDV重組N蛋白，制備

2、成功4株N蛋白單克隆抗體，并利用其中一株單抗建立了抗原捕獲ELISA抗體檢測(cè)方法，為PEDV的診斷和血清學(xué)調(diào)查提供了重要工具。具體內(nèi)容如下:
　　1.表達(dá)PEDV N蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建和鑒定
　　采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得PEDV N基因，將其克隆到供體質(zhì)粒pFastBac中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確后，將重組供體質(zhì)粒pFastBac-N轉(zhuǎn)化到含有穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細(xì)菌中，經(jīng)過(guò)兩輪藍(lán)

3、白斑篩選和PCR鑒定后，獲得重組穿梭載體Bacmid-N。采用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。經(jīng)Westernblot鑒定，重組桿狀病毒可正確表達(dá)PEDVN蛋白，大小約為58KD。采用Ni-NTA親和層析方法獲得純化重組N蛋白，為PEDV診斷和亞單位疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.PEDVN蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
　　采用RT-PCR擴(kuò)增獲得PEDV N基因并克隆至原核表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化到宿主表

4、達(dá)菌BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和Ni柱純化，SDS-PAGE和Western Blot鑒定結(jié)果顯示，重組N蛋白大小約為58KD。將純化的重組N蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合，PEDV N蛋白間接ELISA方法篩選，制備獲得4株能穩(wěn)定分泌N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)證明其與PEDV和真核表達(dá)的N蛋白均有特異性反應(yīng)，單抗亞類(lèi)鑒定均屬于IgG1，輕鏈為κ型

5、。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA抗體效價(jià)為1∶1600～6400，腹水ELISA抗體效價(jià)達(dá)1∶1.024105以上;4株細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)20代，其ELISA抗體效價(jià)基本一致，為PEDV診斷和致病機(jī)制研究提供了有用工具。
　　3.PEDV抗原捕獲ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　本研究采用PEDVN蛋白單克隆抗體包被酶標(biāo)板，純化的PEDV作為捕獲抗原，成功建立了PEDV抗原捕獲ELISA抗體檢測(cè)方法，其優(yōu)化的反應(yīng)條件為:單抗包

6、被濃度為2μg/mL，37℃包被2h加4℃過(guò)夜;5％脫脂乳的磷酸緩沖液作為封閉液，37℃封閉3h;捕獲抗原濃度為5μg/mL，37℃下作用3h;檢測(cè)豬血清1∶50稀釋?zhuān)?7℃作用1h;羊抗豬IgG-HRP稀釋度為1∶2000，37℃作用45min;底物最佳作用時(shí)間為37℃10min。采用S/P值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定陰、陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式計(jì)算S/P值:如果S/P值≥0.4時(shí)為陽(yáng)性，S/P值＜0.3時(shí)為陰性，介于兩者之間為可疑。該ELISA方