豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白在昆蟲細胞中的表達及間接ELISA抗體診斷方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒感染是由豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的一種新傳染病，母豬表現(xiàn)為繁殖障礙，仔豬和斷奶豬主要特征為豬體質(zhì)下降，消瘦，呼吸困難，咳喘，腹瀉和黃疸等。該病毒與多種豬病相關(guān)，主要引起仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、繁殖障礙、豬呼吸綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎、滲出性皮炎，仔豬先天性展頗等。尤其PMWS，該病最早于1991年在加拿大西部發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及

2、黃疸等，病原學及血清學調(diào)查表明，該病在許多國家都廣泛存在，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，建立有效快速的PCV2檢測診斷方法非常有必要。目前PCV2的診斷方法主要有病毒的分離和鑒定、PCR法、免疫熒光法和ELISA法等。相比而言，ELISA法操作較為簡單。研究通過基因的克隆和桿狀病毒表達，以初步建立ELISA檢測方法，用于PCV2抗體檢測。
　　 PCV2含有兩個主要的閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼復制相關(guān)蛋白（re

3、p）和核衣殼蛋白（cap），其中Cap含有病毒主要抗原表位，因此選擇ORF2全長基因及部分基因（去掉定位基團）為目的基因。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的PCV2基因序列設(shè)計了2對引物，并含有Sal I和Not I酶切位點。用PCR技術(shù)從國內(nèi)分離的PCV2毒株獲得大小為702bp（Cap）和579bp（△Cap）的PCR產(chǎn)物，將其克隆至pMD18-T載體，提取質(zhì)粒經(jīng)Sal I和Nol I雙酶切鑒定并測序，序列測定結(jié)果表明，擴增的Cap/△C

4、ap基因與PCV2株核苷酸序列符合率100％，氨基酸序列符合率100％。將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別進行雙酶切，經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-Cap和pFastBac1-△Cap，提取陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的受體菌E.coliDH10Bac，篩選出白色菌落得到重組穿梭載體Bacmid-Cap/Bacmid-△Cap，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性后，轉(zhuǎn)染Sf9昆