豬流行性腹瀉病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用及Nsp2蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一種豬的急性并高度接觸性傳染病，PEDV感染后可導(dǎo)致水樣腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，成年豬很少表現(xiàn)出臨床癥狀。從1976年開(kāi)始我國(guó)就陸續(xù)有PED的報(bào)道，自2010年下半年以來(lái)，該病的流行強(qiáng)度和流行區(qū)域在不斷的加強(qiáng)和擴(kuò)大，對(duì)哺乳仔豬致死率較高，臨床上與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒和大

2、腸桿菌等疫病較難鑒別診斷，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究將純化的豬流行性腹瀉病毒和N蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，用于PEDV抗體的檢測(cè)和血清學(xué)調(diào)查。此外，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得重組蛋白Nsp2，將純化的Nsp2蛋白免疫小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備N(xiāo)sp2蛋白的單克隆抗體，為PEDV診斷和致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:
　　1.PEDV全病毒抗原間接ELISA檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用
　　

3、采用差速離心方法獲得純化PEDV，作為包被抗原，建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并確定其臨界值，同時(shí)進(jìn)行特異性、敏感性、重復(fù)性及符合率試驗(yàn)，優(yōu)化反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為3μg/ml，包被時(shí)間為37℃作用2h，1.5％BSA37℃封閉3h，待檢血清樣品稀釋度為1∶100，作用時(shí)間為1h，酶標(biāo)SPA1∶10，000稀釋，37℃作用30min，抗體臨界值為OD450nm≥0.306判為陽(yáng)性，OD450nm≤0.268

4、判為陰性，介于二者之間為可疑。該方法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟、豬偽狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗體均為陰性，批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)較好，對(duì)江蘇、上海、浙江、安徽地區(qū)587份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率達(dá)60.31％,與TSZ公司的PEDV抗體檢測(cè)試劑盒比較，其符合率為91.3％、證明該方法具有較好敏感性、特異性、重復(fù)性及符合率，可用于PEDV抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.PEDVN蛋白間接ELISA檢測(cè)方法

5、的建立與初步應(yīng)用
　　將PEDVN蛋白基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體，表達(dá)獲得重組N蛋白，SDS-PAGE和Western-blot鑒定結(jié)果顯示，該蛋白分子量大小為55KDa，具有良好的反應(yīng)原性和特異性。采用親和層析純化獲得純化重組N蛋白，作為包被抗原，建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，優(yōu)化反應(yīng)條件為:抗原最佳包被濃度為0.8μg/ml，血清樣品最佳稀釋度為1∶100，包被時(shí)間為37℃作用2h后4℃過(guò)夜，1％BSA37℃封閉3h，待檢血

6、清作用時(shí)間為1h，酶標(biāo)SPA1∶15，000稀釋，37℃作用45min，抗體臨界值為OD450nm≥0.312判為陽(yáng)性，OD450nm≤0.265判為陰性，介于二者之間為可疑。該方法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟、豬偽狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗體均為陰性，批間和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為2.6％～9.3％。對(duì)江蘇、上海、浙江、安徽地區(qū)458份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率達(dá)69.21％。與TSZ公司的PEDV抗體檢測(cè)試劑盒

7、比較，其符合率為89.13％;與建立的豬流行性腹瀉全病毒抗原間接ELISA抗體檢測(cè)方法進(jìn)行符合率比較，符合率為90％，證明該間接ELISA方法可以為PEDV診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。
　　3.PEDVNsp2基因原核表達(dá)與純化及單克隆抗體的制備
　　為表達(dá)PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2，本研究采用PCR方法從PEDV陽(yáng)性組織病料中擴(kuò)增Nsp2基因，，將其克隆至pET-32a載體，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受

8、態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE和Westernblot鑒定，獲得重組蛋白Nsp2大小約50KD。成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Nsp2，并應(yīng)用親和層析方法純化了重組Nsp2蛋白;以純化的PEDVNsp2蛋白免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行篩選，獲得了1株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6B6。測(cè)其細(xì)胞上清效價(jià)為1∶3，200，腹水效價(jià)為1∶2.048×105;Western