奶牛子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞永生化的建立.pdf

1、繁殖障礙性疾病一直阻礙著奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，妊娠失敗是引起奶牛生產(chǎn)性能下降的重要因素。胚胎在母體子宮形成時(shí)，就開始向母體發(fā)出信號(hào)，引起母體的免疫應(yīng)答，發(fā)生一系列的妊娠免疫耐受反應(yīng)，保證胎兒的正常著床、生長和發(fā)育。而奶牛子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞對(duì)于體外探索奶牛生理繁殖學(xué)具有重要意義，但是由于獲得子宮內(nèi)膜腔上皮原代細(xì)胞途徑繁瑣、培養(yǎng)條件高、生長速度慢和增殖能力有限等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了基礎(chǔ)科學(xué)研究的開展。
　　本實(shí)驗(yàn)使用健康的子宮內(nèi)膜組織，分

2、離并培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞(EECs)，不斷純化和傳代。將含有外源基因hTERT（人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶）的載體導(dǎo)入生長狀態(tài)良好的第3或4代細(xì)胞，待細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，篩選出陽性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，獲得的細(xì)胞即為永生化的奶牛子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞(imEECs)。該細(xì)胞不僅保留了原代細(xì)胞的生物學(xué)活性，還具有相對(duì)無限增殖的能力，為后續(xù)的妊娠免疫機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(1)組織塊培養(yǎng)法和胰酶消化法相結(jié)合獲取原代細(xì)胞，4天后就有細(xì)胞爬出，為不規(guī)則圓

3、形或橢圓形，細(xì)胞之間緊密連接，界限清晰，形似鋪路石，呈“島嶼狀”生長，特異性角蛋白-18染色為陽性。
　　(2)選取生長良好的第3代細(xì)胞，利用脂質(zhì)體來完成轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒pCI-neo-hTERT轉(zhuǎn)入細(xì)胞。經(jīng)過500μg/mL濃度的G418篩選，獲取陽性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，其生長速度快，已經(jīng)傳至70代。角蛋白-18染色仍為陽性，免疫熒光方法檢測30代和50代hTERT-BEECs中hTERT表達(dá)為陽性，而原代細(xì)胞呈陰性，說明外源基因成功轉(zhuǎn)入

4、EECs并正常表達(dá)。
　　(3) IFN-τ(1μg/mL)處理EECs和hTERT-BEECs24 h，利用RT-PCR檢測MX(MX1、MX2)和IRF（IRF1、IRF2、IRF9）在基因水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示EECs和hTERT-BEECs中MX、IRF表達(dá)均為陽性，說明hTERT-BEECs依然保留EECs的生物學(xué)活性，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)論:通過外源基因hTERT導(dǎo)入EECs，實(shí)現(xiàn)了奶牛子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞的