hTERT誘導(dǎo)上皮細胞永生化的機制研究.pdf

1、人體組織中端粒酶(Telomerase)的表達具有特異性分布特點，胚系細胞、成體干細胞、永生化細胞和惡性腫瘤細胞中均有端粒酶活性的表達，而正常體細胞中則無活性的端粒酶。轉(zhuǎn)染外源性端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)可以激活端粒酶活性，維持端粒長度，誘導(dǎo)細胞永生化。目前學(xué)者們通過轉(zhuǎn)染外源性TERT已經(jīng)成功獲得多個永生化細胞株，如成纖維細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、前列腺上皮細胞、內(nèi)皮細胞、乳腺上皮細胞等。但是對于外源性TERT基因致上皮細胞永生化的機制

2、尚不明確。
　　 目的：采用編碼人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的逆轉(zhuǎn)錄載體分別感染口腔黏膜上皮(OME)細胞和HaCaT細胞，構(gòu)建hTERT+-OME和hTERT+-HaCaT永生化細胞株，通過檢測轉(zhuǎn)染后永生化細胞株p16、p21、p53和Bmi-1的表達變化，探討外源性hTERT致上皮細胞永生化的分子機制。
　　 方法：⑴pLXSNneo-hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由本課題組構(gòu)建，包裝PA317細胞后，獲得含hTER

3、T基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的高病毒滴度產(chǎn)毒細胞系，于本實驗室-80℃冰箱保存。⑵收取黏膜上皮組織，Dispase酶及胰酶雙重消化法制備上皮單細胞懸液，角化細胞無血清培養(yǎng)基(Keratinocyte-serum free medium，K-SFM)培養(yǎng)。免疫細胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC)鑒定細胞的上皮來源。HaCaT細胞系由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理實驗室提供。⑶收集病毒包裝細胞PA317的培養(yǎng)上清液，分別感染OME和HaC

4、aT細胞，G418篩選抗性克隆，擴增培養(yǎng)，獲得永生化hTERT+-OME細胞株以及hTERT+-HaCaT細胞株。永生化成釉細胞瘤細胞株hTERT+-AM本實驗室-80℃冰箱保存。⑷采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；ICC檢測廣譜細胞角蛋白(PAN-cytokeratin，pCK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)表達；繪制細胞生長曲線；計算細胞群體倍增時間(Doubling Time，DT)及群體倍增數(shù)(Population Doubl

5、ings，PDL)，繪制細胞倍增曲線；兩步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染前后OME和HaCaT細胞中hTERT、p16、p21、p53和Bmi-lmRNA的表達情況；Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后OME和HaCaT細胞中hTERT、p16、p21、p53和Bmi-1蛋白的表達情況；以2×106個細胞接種裸鼠檢測腫瘤形成。<

6、br>　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的OME細胞于5-6d后鋪滿六孔板底壁，呈典型的“鋪路石”樣，ICC鑒定pCK陽性、Vim陰性。②轉(zhuǎn)染hTERT基因后形成的hTERT+-OME及hTERT+-HaCaT細胞保持了上皮特性；細胞生長曲線顯示細胞分裂增殖迅速，很快即進入對數(shù)生長期；倍增曲線表現(xiàn)出無限細胞系的特點，兩個細胞株P(guān)DL值均超過80；裸鼠成瘤實驗均未見成瘤。③RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的OME及HaCaT細胞