Commexin43在斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用.pdf

1、Cx43是第一個(gè)在心肌和其他組織發(fā)現(xiàn)并且是表達(dá)最廣泛的一個(gè)連接蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cx43的基因突變與許多人類的發(fā)育缺陷有關(guān),包括耳聾、外周神經(jīng)病和先天性的心臟病以及血液系統(tǒng)疾病。研究cx43基因在個(gè)體發(fā)育中的作用有助于理解各種相關(guān)先天性疾病特別是心血管疾病的發(fā)生的機(jī)制,為治療提供新的思路。在已有的研究中已經(jīng)證實(shí),cx43的基因敲除小鼠在胚胎期表現(xiàn)出明顯的心臟發(fā)育缺陷,主要是右心室和流出道的畸形,但是其確切的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的闡明。

2、　　 由于cx43的基因敲除導(dǎo)致哺乳動(dòng)物的胚胎致死或出生后不久死亡,難以深入研究其對(duì)心血管系統(tǒng)的作用。而斑馬魚是近年來出現(xiàn)的一種良好的模式生物,其體型較小可以通過滲透作用提供氧氣和營養(yǎng),所以即使心血管有嚴(yán)重的畸形也可以存活較長的時(shí)間。此外斑馬魚胚胎發(fā)育期,通體透明便于觀測(cè),且心臟發(fā)育在進(jìn)化上與哺乳動(dòng)物具有高度的保守性,因此斑馬魚被認(rèn)為是研究心血管早期發(fā)育良好的模式生物。所以利用斑馬魚研究cx43在心血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

3、
　　 第一部分利用生物信息學(xué)的方法證明cx43在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過程中,結(jié)構(gòu)和蛋白的功能結(jié)構(gòu)域上非常保守。并且用RNA全胚胎原位雜交的方法和RT—PCR技術(shù)對(duì)cx43基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中表達(dá)譜進(jìn)行了研究。
　　 第二部分設(shè)計(jì)了兩個(gè)嗎林修飾的反義寡核苷酸干擾cx43翻譯起始位點(diǎn),建立了cx43基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚模型。為了驗(yàn)證嗎啉修飾的反義寡核苷酸的有效性,將其與編碼cx43-EGFP融合蛋白的cx43-E6FP

4、 DNA共注射,結(jié)果顯示cx43-MO抑制了cx43-EGFP融合蛋白的表達(dá),從而也驗(yàn)證了cx43-mo能夠有效抑制內(nèi)源性的cx43的表達(dá)；同時(shí)也驗(yàn)證了cx-43-mo的特異性。
　　 第三部分cx43基因表達(dá)下調(diào)后用原位雜交和原位免疫熒光檢測(cè)心臟標(biāo)志基因的表達(dá)以及心臟的表型,同時(shí)利用顯微熒光造影和原位雜交檢測(cè)血管的發(fā)育情況。用心室心房的標(biāo)志基因vmhc和amhc反義RNA探針進(jìn)行的原位雜交結(jié)果顯示vmhc表達(dá)下調(diào),而amhc表

5、達(dá)上調(diào)；原位免疫熒光顯示與原位雜交一致的結(jié)果:心房擴(kuò)張心室縮小,并且心臟環(huán)化不全。用血管標(biāo)志基因flk-1的RNA探針原位雜交和顯微熒光造影表明cx43基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚胚胎血管無明顯缺陷。此外cx43基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚胚胎心臟功能也有明顯改變,包括心臟搏動(dòng)無力,有血液回流現(xiàn)象。但是下調(diào)cx43基因的表達(dá)對(duì)胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育無明顯干擾作用。
　　 第四部分研究證明:cx43在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)有明顯表達(dá)。Cx43基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)