Commexin43在斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用.pdf

1、Cx43是第一個在心肌和其他組織發(fā)現(xiàn)并且是表達最廣泛的一個連接蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cx43的基因突變與許多人類的發(fā)育缺陷有關,包括耳聾、外周神經(jīng)病和先天性的心臟病以及血液系統(tǒng)疾病。研究cx43基因在個體發(fā)育中的作用有助于理解各種相關先天性疾病特別是心血管疾病的發(fā)生的機制,為治療提供新的思路。在已有的研究中已經(jīng)證實,cx43的基因敲除小鼠在胚胎期表現(xiàn)出明顯的心臟發(fā)育缺陷,主要是右心室和流出道的畸形,但是其確切的機制還有待于進一步的闡明。

2、　　 由于cx43的基因敲除導致哺乳動物的胚胎致死或出生后不久死亡,難以深入研究其對心血管系統(tǒng)的作用。而斑馬魚是近年來出現(xiàn)的一種良好的模式生物,其體型較小可以通過滲透作用提供氧氣和營養(yǎng),所以即使心血管有嚴重的畸形也可以存活較長的時間。此外斑馬魚胚胎發(fā)育期,通體透明便于觀測,且心臟發(fā)育在進化上與哺乳動物具有高度的保守性,因此斑馬魚被認為是研究心血管早期發(fā)育良好的模式生物。所以利用斑馬魚研究cx43在心血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用具有獨特的優(yōu)勢。

3、
　　 第一部分利用生物信息學的方法證明cx43在脊椎動物的進化過程中,結構和蛋白的功能結構域上非常保守。并且用RNA全胚胎原位雜交的方法和RT—PCR技術對cx43基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中表達譜進行了研究。
　　 第二部分設計了兩個嗎林修飾的反義寡核苷酸干擾cx43翻譯起始位點,建立了cx43基因表達下調的斑馬魚模型。為了驗證嗎啉修飾的反義寡核苷酸的有效性,將其與編碼cx43-EGFP融合蛋白的cx43-E6FP

4、 DNA共注射,結果顯示cx43-MO抑制了cx43-EGFP融合蛋白的表達,從而也驗證了cx43-mo能夠有效抑制內源性的cx43的表達；同時也驗證了cx-43-mo的特異性。
　　 第三部分cx43基因表達下調后用原位雜交和原位免疫熒光檢測心臟標志基因的表達以及心臟的表型,同時利用顯微熒光造影和原位雜交檢測血管的發(fā)育情況。用心室心房的標志基因vmhc和amhc反義RNA探針進行的原位雜交結果顯示vmhc表達下調,而amhc表

5、達上調；原位免疫熒光顯示與原位雜交一致的結果:心房擴張心室縮小,并且心臟環(huán)化不全。用血管標志基因flk-1的RNA探針原位雜交和顯微熒光造影表明cx43基因表達下調的斑馬魚胚胎血管無明顯缺陷。此外cx43基因表達下調的斑馬魚胚胎心臟功能也有明顯改變,包括心臟搏動無力,有血液回流現(xiàn)象。但是下調cx43基因的表達對胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育無明顯干擾作用。
　　 第四部分研究證明:cx43在內細胞團(ICM)有明顯表達。Cx43基因表達下調導