放射線(xiàn)誘導(dǎo)定向基因治療阻斷肺放射性纖維化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射性肺纖維化是胸部腫瘤病人放射治療后常見(jiàn)的并發(fā)癥，至今仍缺乏理想的治療手段。隨著對(duì)放射性肺纖維化發(fā)病機(jī)制的深入研究，以及分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因治療有望成為新的治療肺纖維化的有效手段。目前認(rèn)為，放射性肺纖維化是多種細(xì)胞因子參與的，多細(xì)胞多系統(tǒng)的作用結(jié)果，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是目前公認(rèn)的最重要的細(xì)胞因子之一。Smad7是TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的阻抑因子。已有實(shí)驗(yàn)證明外

2、源性Smad7基因阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，能夠明顯抑制博萊霉素所致的肺纖維化。但是，在機(jī)體內(nèi)TGF-β廣泛存在，生理作用多樣而復(fù)雜，如果廣泛阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路，可能會(huì)產(chǎn)生一系列的病理生理變化，對(duì)機(jī)體造成不良影響。因此如何靶向性阻斷TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)通路是基因治療肺纖維化能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵因素。 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子(earlygrowthresponse．1，Egr-1)是一種具有輻射誘導(dǎo)基因表達(dá)特性的基因啟動(dòng)子。利用Egr

3、-1的這一特性，若能將Egr-1的基因啟動(dòng)子與Smad7目的基因一起整合到腺病毒載體中，感染小鼠，經(jīng)放射線(xiàn)照射后，激活Egr-1基因啟動(dòng)子，使其在放射區(qū)域內(nèi)調(diào)控下游Smad7基因的高表達(dá)，區(qū)域性阻斷TGF-β的作用通路，可能對(duì)放射性肺纖維化產(chǎn)生靶向性基因治療的作用。這方面的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究將放射性敏感性元件Egr-l基因啟動(dòng)子和目的基因Smad7cDNA串聯(lián)整合到腺病毒載體內(nèi)，構(gòu)建成重組腺病毒(AD．Egr-Sm

4、ad7)：選擇C57BL小鼠為研究對(duì)象，經(jīng)由氣管內(nèi)給藥后制備放射性肺纖維化模型，研究外源性Smad7基因放射區(qū)域內(nèi)靶向性阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而定向基因治療放射性肺纖維化的機(jī)制及療效，并從重組腺病毒對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為影響的角度，探討其安全性。本研究系臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為未來(lái)開(kāi)發(fā)臨床上放射性肺纖維化的新的治療手段提供理論依據(jù)。 研究C57BL小鼠對(duì)氣管內(nèi)途徑給AD．Egr-Smad7的耐受性；探討外源性Smad7基因在

5、肺組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的定位，表達(dá)與放射劑量、放射后時(shí)相及重組腺病毒滴度的關(guān)系；觀察輻射誘導(dǎo)AD．Egr-Smad7抑制小鼠放射性肺纖維化模型的肺纖維化發(fā)生的療效并探討其作用機(jī)制；觀察AD．Egr-Smad7是否具有促進(jìn)小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)及發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的潛在危險(xiǎn)性，確定重組腺病毒定向基因治療放射性肺纖維化的安全性。 將Egr-1基因啟動(dòng)子的放射敏感元件和目的基因Smad7cDNA包裝到復(fù)制缺陷型腺病毒內(nèi)，制備成重組腺病毒AD．Egr

6、-Smad7。動(dòng)物采用8—10周齡雄性C57BL／6J小鼠，隨機(jī)分組。氣管內(nèi)給藥24小時(shí)后，以Y射線(xiàn)全胸腔放射。小鼠氣管內(nèi)給不同滴度的重組腺病毒，通過(guò)觀察急性反應(yīng)及死亡情況來(lái)確定小鼠對(duì)重組腺病毒的安全耐受滴度范圍：通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，研究輻射誘導(dǎo)后外源性Smad7基因肺組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的定位。采用Westernblot印跡法檢測(cè)不同放射劑量、放射后不同時(shí)間及不同重組腺病毒滴度時(shí)小鼠肺組織外源性Smad7蛋白的表達(dá)，探討輻射誘導(dǎo)后其表達(dá)與

7、放射劑量、放射后時(shí)相間及重組腺病毒滴度的關(guān)系。于放射后不同時(shí)間，用ELISA法檢測(cè)肺組織內(nèi)TGF-p1、CTGF、I型及II工型膠原含量；比色法測(cè)定羥脯氨酸含量；光鏡下病理組織學(xué)觀察肺泡炎及肺纖維化程度，研究輻射誘導(dǎo)AD．Egr-Smad7定向基因治療放射性肺纖維化的療效，并探討其作用機(jī)制。觀察AD．Egr-Smad7對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠模型腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)、腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間、小鼠生存時(shí)間及肺部轉(zhuǎn)移發(fā)生情況的影響，確定AD．Egr-Sm

8、ad7是否具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的潛在危險(xiǎn)性，證明重組腺病毒定向基因治療放射性肺纖維化的安全性。 1．Y射線(xiàn)照射可明顯誘導(dǎo)Egr-1基因啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的Smad7基因在C57BL小鼠肺內(nèi)表達(dá)(oR=0．2，P=0．0000，P<0．01)。重組腺病毒滴度在109pfu及以下時(shí)，小鼠可安全耐受，各組小鼠均存活，而重組腺病毒滴度在5×109pfu及以上時(shí)，每組6只小鼠中有5只以上死亡。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示外源性Sma

9、d7基因在肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)均有明顯表達(dá)，而各對(duì)照組未見(jiàn)表達(dá)。2．外源性Smad7基因表達(dá)隨重組腺病毒滴度升高而增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

10、鼠肺組織內(nèi)TGF-p、I、Ⅲ型膠原及羥脯氨酸含量的作用，與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

11、放射后2周AD．Egr-Smad7組與空白組比較P=0．1300，P>O．05；空白組與NS組比較P=0．7203，P>0．05。腫瘤體積生長(zhǎng)至放射前4倍時(shí)AD．Egr-Smad7組與空白組比較P=0．5610，P>0．05；空白組組與NS組比較P=I，P>0．05)。 1．以腺病毒為載體，輻射誘導(dǎo)Egr-1啟動(dòng)子能夠調(diào)控外源性Smad7基因在小鼠肺組織各種細(xì)胞胞漿內(nèi)廣泛表達(dá)，在作用場(chǎng)所上有阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，靶向性基因

12、治療放射性肺纖維化的可能性：重組腺病毒滴度在109pfu及以下時(shí)，小鼠可安全耐受。2．輻射誘導(dǎo)后，外源性Smad7基因的表達(dá)隨重組病毒滴度升高而增加，并與放射劑量及放射后間隔時(shí)間有關(guān)，輻射誘導(dǎo)外源性Smad7基因的表達(dá)具有一定的穩(wěn)定性及規(guī)律性。3．輻射誘導(dǎo)后，Egr-1啟動(dòng)子調(diào)控的外源性Smad7基因靶向性阻斷TGF．B信號(hào)傳導(dǎo)通路，一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)定向阻斷放射性肺纖維化發(fā)生的作用。4．輻射誘導(dǎo)后，外源性Smad7基因無(wú)促進(jìn)小鼠Lew