三種蝦蟹Cyclin B的定位和分子克隆.pdf

1、生物的生長發(fā)育需要對細(xì)胞周期進(jìn)行精確協(xié)調(diào)的時(shí)空調(diào)控，而細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是細(xì)胞周期的推動力。細(xì)胞周期蛋白有多種，Cyclin B為其中一種，與催化亞基cdc2組成全酶復(fù)合物，即成熟促進(jìn)因子(MPF)，參與細(xì)胞分裂的多個事件的發(fā)生和進(jìn)行。本文采用免疫組化方法和分子生物學(xué)技術(shù)，在擬穴青蟹的精巢中定位了Cyclin B蛋白，克隆了長毛明對蝦和凡納濱對蝦卵巢Cyclin B基因，從而為甲殼類生殖調(diào)控機(jī)制的研究及水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展提供基礎(chǔ)資

2、料。主要結(jié)果如下： 1.擬穴青蟹精巢Cyclin B蛋白的免疫組化定位。 運(yùn)用組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法，確定了所選擬穴青蟹精巢的成熟程度，然后對擬穴青蟹精巢中的Cyclin B蛋白進(jìn)行定位。在所選擬穴青蟹的精巢組織中，Cyclin B蛋白主要分布在精母細(xì)胞期，直至精子細(xì)胞仍然存在。Cyclin B蛋白在精母細(xì)胞中大量表達(dá)，在精子細(xì)胞少量，出現(xiàn)陽性的精母細(xì)胞的染色質(zhì)有的濃縮成團(tuán)，反之則成染色質(zhì)絲，其中濃縮成團(tuán)的精母細(xì)胞的

3、陽性結(jié)果更為明顯。上述結(jié)果表明：在擬穴青蟹精子發(fā)生過程中，Cyclin B表達(dá)和蛋白定位具有發(fā)育階段依賴性的特征。陰性對照組未出現(xiàn)陽性信號。 2.長毛明對蝦和凡納濱對蝦Cyclin B基因的克隆和分析。 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，分別研究長毛明對蝦和凡納濱對蝦卵巢Cyclin B基因，結(jié)果如下： ①分別克隆長毛明對蝦和凡納濱對蝦卵巢Cyclin B基因 在NCBI上查找已報(bào)道的Cyclin B基因序列，通過對已

4、知物種的CyclinB序列比對，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti，GeneBank登錄號：XM_001660578)、麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis，GeneBank登錄號：XM_001605776)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus，GeneBank登錄號：AY769095)、水蚤(Daphniapulex，Joint Genome Institute，JGI)，設(shè)計(jì)一對簡并引物

5、BFP和BRP，擴(kuò)增出了長毛明對蝦和凡納濱對蝦Cyclin B基因的片段。根據(jù)己得到序列片段設(shè)計(jì)引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增和基因克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，分別克隆出長毛明對蝦和凡納濱對蝦Cyclin B基因的全長cDNA序列，推導(dǎo)出其氨基酸序列，并提交給GeneBank。 長毛明對蝦Cyclin B基因序列全長為1927bp，含有一個完整的開放閱讀框，長1428bp，編碼的成熟肽有475個氨基酸組成，分子量的理論值為54763.

6、7Da，等電點(diǎn)為6.19，推測該成熟肽有6個可能的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，不具信號肽。分析該蛋白可能定位于細(xì)胞核內(nèi)。 凡納濱對蝦Cyclin B基因序列全長為2326bp，含有一個完整的開放閱讀框，長1803bp，編碼的成熟肽有600個氨基酸組成，分子量的理論值為69688.0Da，等電點(diǎn)為6.32，推測該成熟肽有9個可能的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，不具信號肽。分析該蛋白可能定位于細(xì)胞核內(nèi)。 ②長毛明對蝦和凡納濱對蝦Cyclin B基

7、因同源性分析。 推測長毛明對蝦演繹的Cyclin B蛋白有兩個拷貝的氨基酸保守區(qū)，分別位于248—333和341—427位氨基酸之間，屬于細(xì)胞周期蛋白超家族(Cyclin Super—family)，是細(xì)胞周期蛋白盒(Cyclin box)的折疊區(qū)域。每個拷貝里面都有兩個結(jié)合位點(diǎn)，第一個結(jié)合位點(diǎn)包括9個氨基酸位點(diǎn)，第二個結(jié)合位點(diǎn)包括6個氨基酸位點(diǎn)，為與CDK、DNA結(jié)合提供識別位點(diǎn)和折疊區(qū)域，在細(xì)胞周期和翻譯過程中起調(diào)節(jié)作用。長

8、毛明對蝦的Cyclin B基因與日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)的同源性高達(dá)93％，而與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、帽貝(Patellavulgata)、斑紋蚌(Dreissena polymorpha)、大西洋浪蛤(Spisula solidissima)、水螅(Hydra viridis)分別有71％、61％、60％、59％、57％的同源性。 推測凡納濱對蝦演繹的Cyclin

9、B蛋白有一個拷貝的氨基酸保守區(qū)，該氨基酸保守區(qū)位于367—458位的氨基酸，屬于細(xì)胞周期蛋白超家族，氨基酸保守區(qū)里包含兩個結(jié)合位點(diǎn)，第一個結(jié)合位點(diǎn)包括2個氨基酸位點(diǎn)，第二個結(jié)合位點(diǎn)包括5個氨基酸位點(diǎn)，為與CDK、DNA結(jié)合提供識別位點(diǎn)和折疊區(qū)域，在細(xì)胞周期和翻譯過程中起調(diào)節(jié)作用。凡納濱對蝦的Cyclin B基因與其它特種的Cyclin B具有不同序列一致性。與日本囊對蝦的同源性達(dá)91％，而與中華絨螯蟹、帽貝、斑紋蚌、大西洋浪蛤、水螅、綠