三種TAK1剪接異構(gòu)體的克隆及其在T細(xì)胞中的表達(dá)和定位研究.pdf

1、本文通過RT-PCR獲得Jurkat T細(xì)胞的總cDNA，然后以其為模板，利用特異引物PCR克隆其中TAKl異構(gòu)體，從7輪篩選中挑了共180個菌落，有138個陽性菌落，其中鑒定為A的有126個(91.3％)，B有6個(4.35％)，D有6個(4.35％)，但沒有克隆到C異構(gòu)體。進(jìn)一步構(gòu)建了它們的EYFP和Flag標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)載體。 其次，利用Western技術(shù)檢測了A、B、D三種異構(gòu)體在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)所有三

2、種異構(gòu)體都有兩條大小相差約10KD的特異的蛋白條帶。 然后，利用免疫染色和共聚焦顯微技術(shù)研究了EYFP和Flag標(biāo)記的三種TAKl異構(gòu)體的融合蛋白在未刺激狀態(tài)下的Jurkat T細(xì)胞和293T細(xì)胞中的定位，確定了在未刺激狀態(tài)下TAlKl A、B、D三種異構(gòu)體都是定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的。 最后，結(jié)合生物信息學(xué)的分析手段，對實驗結(jié)果進(jìn)行了初步分析，推論在TCR信號通路被激活的狀態(tài)下，TAKl A、B、D三種異構(gòu)體在T細(xì)胞內(nèi)具有不同