腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動(dòng)物模型制作方法研究.pdf

1、目的:
　　 探討腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作方法,為研究中醫(yī)藥治療腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的作用及其機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)工具,并以期為病證結(jié)合動(dòng)物模型的制作提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 本課題分為兩部分實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研究:
　　 實(shí)驗(yàn)一:選用6周齡SPF級(jí)SD大鼠80只、Wistar大鼠80只、Lewis大鼠40只,雌雄各半。采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法

2、誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎模型,對(duì)不同品系、不同性別大鼠在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen—induced arthritis,CIA)模型中的發(fā)病情況進(jìn)行比較研究。
　　 實(shí)驗(yàn)二:選用6周齡SPF級(jí)SD大鼠100只,雌雄各半,除對(duì)照組大鼠外,分別切除大鼠的雙側(cè)睪丸和卵巢,制作腎虛動(dòng)物模型。分別在去勢(shì)1周、2周、3周、4周后,采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎模型,從而對(duì)不同去勢(shì)時(shí)間(即不同腎虛狀態(tài))下,CI

3、A發(fā)病情況進(jìn)行比較研究,并采用ELISA等方法對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探討。
　　 結(jié)果:
　　 實(shí)驗(yàn)一:
　　 對(duì)三種不同品系大鼠發(fā)病情況數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)不同種屬發(fā)病率不同,X2=72.94,P<0.0001；時(shí)間與發(fā)病率相關(guān),X2=15.39,P=0.0005,有顯著性差異,隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)病率越高。兩兩比較顯示,SD和Wistar大鼠與Lewis大鼠發(fā)病率有顯著性差異(P均<0.0001),但SD與Wi

4、star無(wú)顯著性差異(P=0.6183)。
　　 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示:(1)不同品系大鼠AI不同,有顯著性差異(P<0.0001)；組間兩兩比較結(jié)果顯示:Lewis比SD、wistar大鼠AI低,有顯著性差異(P<0.0001),且SD比wistar大鼠AI高,差異亦具有顯著性(P=0.045)。(2)性別對(duì)AI沒有影響(P=0.737)。免疫28d內(nèi)各時(shí)段與其他時(shí)間相比均有顯著性差異(P<0.0001),28d后各時(shí)段比

5、無(wú)顯著性差異(P均>0.05)。
　　 顯著性檢驗(yàn)考慮性別和屬種兩因素對(duì)病理積分的影響,采用雙因素方差分析統(tǒng)計(jì),總體方差分析結(jié)果顯示性別對(duì)病理積分影響無(wú)顯著性(P>0.05),種屬對(duì)病理積分影響有顯著性差異(P<0.05)。兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn),結(jié)果顯示,Lewis比SD、Wistar大鼠關(guān)節(jié)病理積分低,有顯著性差異(P<0.05),而SD與Wistar大鼠之間無(wú)顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)二:
　　 對(duì)不同去勢(shì)

6、時(shí)間關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)對(duì)照CIA組大鼠與CIA去勢(shì)組大鼠,或者不同去勢(shì)時(shí)間CIA大鼠發(fā)病率影響沒有顯著性差異(P=0.9159)。
　　 重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示:(1)性別對(duì)AI沒有影響(P=0.667)；(2)與對(duì)照CIA組相比,與去勢(shì)4周組AI明顯升高(P=0.006),與去勢(shì)1周相比,亦有顯著性差異(P=0.014),其余各組之間相比均無(wú)顯著性差異。
　　 考慮性別和去勢(shì)時(shí)間兩因素對(duì)病理積分的影

7、響,采用雙因素方差分析統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示性別對(duì)病理積分影響無(wú)顯著性(P>0.05),去勢(shì)時(shí)間對(duì)病理積分影響有顯著性差異(P<0.05)。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示性別對(duì)CORT影響有顯著性(P<0.0001),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間有交互作用(P<0.05),所以按性別做分層分析可以了解不同性別分組之間的差異。結(jié)果顯示,去勢(shì)后,不同性別大鼠對(duì)CORT的反應(yīng)變化相反,即與未去勢(shì)CIA組比較,雌性去勢(shì)CIA組大鼠血漿CORT水平

8、明顯降低(P<0.01,P<0.05),除去勢(shì)1周組外,雄性大鼠CORT均顯著升高(P<0.01,P<0.05),且與去勢(shì)時(shí)間呈正相關(guān),大鼠去勢(shì)3周血漿CORT與去勢(shì)4周相比,無(wú)顯著性差異。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)顯示性別對(duì)抗Ⅱ型膠原抗體影響無(wú)顯著性(P=0.384),去勢(shì)時(shí)間對(duì)抗Ⅱ型膠原抗體影響有顯著性差異(P<0.0001),LSD法兩兩比較顯示,隨著去勢(shì)時(shí)間增加,抗Ⅱ型膠原抗體明顯升高,與對(duì)照CIA組比較,去勢(shì)2、3、4

9、周CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平明顯升高(P<0.05),去勢(shì)1、2、3、4周CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平有顯著性差異(P<0.05)。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示性別對(duì)IL-6影響有顯著性(P=0.0034),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間無(wú)交互作用(P=0.3356),去勢(shì)時(shí)間對(duì)IL-6影響有顯著性差異(P<0.0001),兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn),結(jié)果顯示,與對(duì)照CIA組比較,去勢(shì)2周、3周、4周CIA組大鼠IL-

10、6水平明顯升高(P<0.05),去勢(shì)1周、2周、3周、4周CIA組大鼠血清IL-6水平亦有顯著性差異(P<0.05),隨著去勢(shì)時(shí)間增加,明顯升高。
　　 雙因素方差分析結(jié)果顯示性別對(duì)IL-10影響有顯著性(P<0.0001),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間無(wú)交互作用(P=0.3356),去勢(shì)時(shí)間對(duì)IL-10影響有顯著性差異(P<0.0001),兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn),結(jié)果顯示,各組CIA組大鼠血漿IL-10水平隨著去勢(shì)時(shí)間增加,明顯升

11、高,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)對(duì)于Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型,Wistar和SD大鼠發(fā)病率和發(fā)病程度均明顯高于Lewis大鼠。Wistar和SD大鼠發(fā)病率無(wú)顯著性差異,但發(fā)病程度SD大鼠明顯高于Wistar大鼠。三種品系大鼠雌雄之間發(fā)病率和發(fā)病程度無(wú)明顯差異。因此,在制作痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)大鼠模型時(shí),建議首選SD大鼠,其次可以選擇Wistar大鼠,雌雄均可。
　　 (2

12、)腎虛在CIA發(fā)病過(guò)程中起著重要作用,隨著去勢(shì)時(shí)間的延長(zhǎng),即腎虛程度加重,CIA有效發(fā)病率和發(fā)病程度亦隨之增加；在去勢(shì)4周后其有效發(fā)病率就可達(dá)到95％,且發(fā)病程度明顯高于同期未去勢(shì)大鼠。因此,在制作腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動(dòng)物模型時(shí),在大鼠去勢(shì)4周時(shí)就可用CII進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。
　　 (3)根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并結(jié)合前期工作基礎(chǔ),腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合大鼠模型的具體制作方法如下:選用SD大鼠,鼠齡6周齡,SPF