腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動物模型制作方法研究.pdf

1、目的:
　　 探討腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動物模型的制作方法,為研究中醫(yī)藥治療腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的作用及其機理提供實驗工具,并以期為病證結(jié)合動物模型的制作提供進一步的科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 本課題分為兩部分實驗來進行研究:
　　 實驗一:選用6周齡SPF級SD大鼠80只、Wistar大鼠80只、Lewis大鼠40只,雌雄各半。采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法

2、誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎模型,對不同品系、不同性別大鼠在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen—induced arthritis,CIA)模型中的發(fā)病情況進行比較研究。
　　 實驗二:選用6周齡SPF級SD大鼠100只,雌雄各半,除對照組大鼠外,分別切除大鼠的雙側(cè)睪丸和卵巢,制作腎虛動物模型。分別在去勢1周、2周、3周、4周后,采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎模型,從而對不同去勢時間(即不同腎虛狀態(tài))下,CI

3、A發(fā)病情況進行比較研究,并采用ELISA等方法對其機理進行初步探討。
　　 結(jié)果:
　　 實驗一:
　　 對三種不同品系大鼠發(fā)病情況數(shù)據(jù)進行動態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)不同種屬發(fā)病率不同,X2=72.94,P<0.0001；時間與發(fā)病率相關(guān),X2=15.39,P=0.0005,有顯著性差異,隨著免疫時間的延長,發(fā)病率越高。兩兩比較顯示,SD和Wistar大鼠與Lewis大鼠發(fā)病率有顯著性差異(P均<0.0001),但SD與Wi

4、star無顯著性差異(P=0.6183)。
　　 重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示:(1)不同品系大鼠AI不同,有顯著性差異(P<0.0001)；組間兩兩比較結(jié)果顯示:Lewis比SD、wistar大鼠AI低,有顯著性差異(P<0.0001),且SD比wistar大鼠AI高,差異亦具有顯著性(P=0.045)。(2)性別對AI沒有影響(P=0.737)。免疫28d內(nèi)各時段與其他時間相比均有顯著性差異(P<0.0001),28d后各時段比

5、無顯著性差異(P均>0.05)。
　　 顯著性檢驗考慮性別和屬種兩因素對病理積分的影響,采用雙因素方差分析統(tǒng)計,總體方差分析結(jié)果顯示性別對病理積分影響無顯著性(P>0.05),種屬對病理積分影響有顯著性差異(P<0.05)。兩兩比較采用LSD法檢驗,結(jié)果顯示,Lewis比SD、Wistar大鼠關(guān)節(jié)病理積分低,有顯著性差異(P<0.05),而SD與Wistar大鼠之間無顯著性差異。
　　 實驗二:
　　 對不同去勢

6、時間關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況數(shù)據(jù)進行動態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)對照CIA組大鼠與CIA去勢組大鼠,或者不同去勢時間CIA大鼠發(fā)病率影響沒有顯著性差異(P=0.9159)。
　　 重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示:(1)性別對AI沒有影響(P=0.667)；(2)與對照CIA組相比,與去勢4周組AI明顯升高(P=0.006),與去勢1周相比,亦有顯著性差異(P=0.014),其余各組之間相比均無顯著性差異。
　　 考慮性別和去勢時間兩因素對病理積分的影

7、響,采用雙因素方差分析統(tǒng)計,結(jié)果顯示性別對病理積分影響無顯著性(P>0.05),去勢時間對病理積分影響有顯著性差異(P<0.05)。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示性別對CORT影響有顯著性(P<0.0001),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間有交互作用(P<0.05),所以按性別做分層分析可以了解不同性別分組之間的差異。結(jié)果顯示,去勢后,不同性別大鼠對CORT的反應(yīng)變化相反,即與未去勢CIA組比較,雌性去勢CIA組大鼠血漿CORT水平

8、明顯降低(P<0.01,P<0.05),除去勢1周組外,雄性大鼠CORT均顯著升高(P<0.01,P<0.05),且與去勢時間呈正相關(guān),大鼠去勢3周血漿CORT與去勢4周相比,無顯著性差異。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計顯示性別對抗Ⅱ型膠原抗體影響無顯著性(P=0.384),去勢時間對抗Ⅱ型膠原抗體影響有顯著性差異(P<0.0001),LSD法兩兩比較顯示,隨著去勢時間增加,抗Ⅱ型膠原抗體明顯升高,與對照CIA組比較,去勢2、3、4

9、周CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平明顯升高(P<0.05),去勢1、2、3、4周CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平有顯著性差異(P<0.05)。
　　 雙因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示性別對IL-6影響有顯著性(P=0.0034),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間無交互作用(P=0.3356),去勢時間對IL-6影響有顯著性差異(P<0.0001),兩兩比較采用LSD法檢驗,結(jié)果顯示,與對照CIA組比較,去勢2周、3周、4周CIA組大鼠IL-

10、6水平明顯升高(P<0.05),去勢1周、2周、3周、4周CIA組大鼠血清IL-6水平亦有顯著性差異(P<0.05),隨著去勢時間增加,明顯升高。
　　 雙因素方差分析結(jié)果顯示性別對IL-10影響有顯著性(P<0.0001),數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間無交互作用(P=0.3356),去勢時間對IL-10影響有顯著性差異(P<0.0001),兩兩比較采用LSD法檢驗,結(jié)果顯示,各組CIA組大鼠血漿IL-10水平隨著去勢時間增加,明顯升

11、高,均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)對于Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型,Wistar和SD大鼠發(fā)病率和發(fā)病程度均明顯高于Lewis大鼠。Wistar和SD大鼠發(fā)病率無顯著性差異,但發(fā)病程度SD大鼠明顯高于Wistar大鼠。三種品系大鼠雌雄之間發(fā)病率和發(fā)病程度無明顯差異。因此,在制作痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)大鼠模型時,建議首選SD大鼠,其次可以選擇Wistar大鼠,雌雄均可。
　　 (2

12、)腎虛在CIA發(fā)病過程中起著重要作用,隨著去勢時間的延長,即腎虛程度加重,CIA有效發(fā)病率和發(fā)病程度亦隨之增加；在去勢4周后其有效發(fā)病率就可達到95％,且發(fā)病程度明顯高于同期未去勢大鼠。因此,在制作腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動物模型時,在大鼠去勢4周時就可用CII進行免疫誘導(dǎo)。
　　 (3)根據(jù)以上實驗結(jié)果,并結(jié)合前期工作基礎(chǔ),腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合大鼠模型的具體制作方法如下:選用SD大鼠,鼠齡6周齡,SPF