蒿芩清膽湯抗流感病毒性肺炎濕熱證及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、濕熱證是由外環(huán)境、機(jī)體的免疫狀態(tài)、病原微生物共同作用的結(jié)果，具有時(shí)間性、地域性；其發(fā)病機(jī)制是機(jī)體在熱暴露和潮濕環(huán)境下，因“濕”“熱”病邪共患，導(dǎo)致脾胃功能失調(diào)，再受到細(xì)菌、病毒等生物因子侵襲，隨之發(fā)生一系列生理病理上的改變。流感病毒是ssRNA分節(jié)段病毒，病毒的變異性大、傳染性強(qiáng)、易造成大流行，多年來一直威脅人類的健康。嶺南地區(qū)高溫多雨，是許多細(xì)菌和病毒的溫床，有研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道病毒感染是嶺南地區(qū)臨床常見病，并且是以流感病毒、副流感病毒

2、感染為主；所以在嶺南地區(qū)研究流感病毒引起的濕熱證意義重大。目前在市面上西醫(yī)抗病毒感染的主要有疫苗和抗病毒制劑，但疫苗的制作存在滯后性，面對(duì)病毒的變異顯得防不勝防；抗病毒的制劑也只有在早期才能達(dá)到預(yù)期效果；而中藥在治療此類疾病有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。臨床上發(fā)現(xiàn)，蒿芩清膽湯在治療流感病毒所引起的發(fā)熱療效顯著；但其作用靶點(diǎn)和機(jī)理尚未明確。因此，探討蒿芩清膽湯對(duì)流感病毒引起的濕熱證的治療作用，并尋找可能的信號(hào)通路，具有其獨(dú)特意義，為該藥治療此類疾病打下理論

3、基礎(chǔ)。 目的: 建立符合臨床癥狀的流感病毒性肺炎濕熱證模型，并用蒿芩清膽湯進(jìn)行治療，觀察蒿芩清膽湯的作用靶點(diǎn)，并探討可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為藥物在疾病治療中奠定理論基礎(chǔ)。 方法: 實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。第一部分：流感病毒肺炎濕熱證模型的建立。將小鼠隨機(jī)分為正常組、病毒組（單純病毒感染造模）、復(fù)合模型組（肥甘飲食+濕熱環(huán)境+病毒感染）。由造模日起，常溫飼養(yǎng)9d，其中對(duì)照組和病毒組用普通飼料喂養(yǎng)，復(fù)合模型組用高脂飼

4、料（普通飼料、蜂蜜、豬油以20：2：3的比例配制；由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心制備）第10d時(shí)復(fù)合模型組及病毒組小鼠滴鼻感染甲1型流感病毒，攻毒量為30LD50，對(duì)照組則滴鼻等量的無菌LB液體培養(yǎng)基。24h后，將復(fù)合模型組置于人工氣候艙進(jìn)行熱暴露3h；溫度（32±0.5）℃，濕度（55～60）%.隔日進(jìn)行熱暴露一次，共3次。由造模之日起，于1d、7d、10d、14d的9：00AM稱各組小鼠體重，并檢測(cè)其肛溫，于5d、8d、10d測(cè)血脂。造模

5、完成后采用RT-PCR檢測(cè)小鼠肺病毒含量并觀察各組小鼠肺組織的病理改變。對(duì)各組小鼠進(jìn)行肛溫、血脂、肺病變程度等方面的比較。第二部份：蒿芩清膽湯對(duì)流感病毒性肺炎濕熱證的作用機(jī)理及其機(jī)制的探討。將小鼠隨機(jī)分為正常組、病毒組（單純病毒感染）、復(fù)合模型組（高脂飲食+濕熱環(huán)境+病毒感染）、陽(yáng)性藥物組（模型組+病毒唑）、蒿芩清膽湯組（模型組+蒿芩清膽湯）。造模方法同實(shí)驗(yàn)第一部分，兩個(gè)藥物組由病毒感染后2小時(shí)內(nèi)給藥，每天給藥兩次。造模結(jié)束后，取各組小

6、鼠肺組織，分別稱量小鼠的體重和肺重，計(jì)算各組小鼠肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率；用免疫組織化學(xué)法測(cè)其肺組織NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)；提取各組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，用RT-PCR的方法檢測(cè)TLR2及NF-κB mRNA的表達(dá)；采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清中IL-4、IFN-γ的濃度，并計(jì)算IFN-γ/IL-4比值來了解機(jī)體Th1/Th2類細(xì)胞的平衡狀態(tài)。 結(jié)論: 1.在遵循“外濕引動(dòng)內(nèi)濕”的前提下，實(shí)驗(yàn)嘗試選用流感病毒作為生物感染因

7、子用“環(huán)境+高脂飲食+生物感染因子”復(fù)制濕熱證模型，該模型從發(fā)病條件、體征，病變程度上不僅符合濕熱證的癥狀，還具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，有較高的應(yīng)用價(jià)值。此研究不僅擴(kuò)大了濕熱證的內(nèi)涵，對(duì)既往模型的研究作了補(bǔ)充，更體現(xiàn)出其明顯的創(chuàng)新性，從另一方面詮釋了濕熱證；此外，還為進(jìn)一步的研究奠定模型基礎(chǔ)。 2.流感病毒性肺炎濕熱證經(jīng)藥物治療后發(fā)現(xiàn)：蒿芩清膽湯能降低模型小鼠的肺指數(shù)，保護(hù)肺組織，減少其免疫損傷；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了蒿芩清膽湯

8、治療流感病毒性肺炎濕熱證的有效性。 3.流感病毒入侵機(jī)體時(shí)，能激活細(xì)胞膜上的TLR2并使其高表達(dá)；蒿芩清膽湯能下調(diào)細(xì)胞膜表面的TLR2 mRNA的表達(dá)，通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，達(dá)到減少其后續(xù)反應(yīng)的目的。 4.流感病毒性肺炎濕熱證的小鼠肺上皮細(xì)胞的NF-κB活性增強(qiáng)、腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高。蒿芩清膽湯能下調(diào)NF-κB mRNA的表達(dá)，和TLR2 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致。 5.流感病毒性肺炎濕熱證小

9、鼠血清中IFN-γ顯著升高，而IL-4的升高并不明顯，Th1/Th2向Th1漂移，細(xì)胞免疫占優(yōu)勢(shì)，造成肺組織損傷，加重病情。蒿芩清膽湯能降低血清中IFN-γ含量，使Th1/Th2類細(xì)胞比值向平衡方向回歸。 6.蒿芩清膽湯是治療流感病毒性肺炎濕熱證的有效藥物；它通過下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的關(guān)鍵分子TLR2和NF-κB mRNA的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。其可能的機(jī)制如下：蒿芩清膽湯通過下調(diào)細(xì)胞膜表面TLR2mRNA的表