肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp2對(duì)頭孢哌酮藥動(dòng)學(xué)影響初探.pdf

1、目的：1.建立內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型，獲得表達(dá)不同水平Mrp2的大鼠模型；
　　 2.研究頭孢哌酮(Cefoperazone，CPZ)在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為；
　　 3.初步闡明分布于肝臟的多藥耐藥相關(guān)蛋白2(Multidrug resistance associatedprotein2，Mrp2)對(duì)CPZ藥動(dòng)學(xué)的影響。
　　 方法：1.內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型的建立：Wistar大鼠頸部

2、皮下注射苯甲酸雌二醇(Estradiol Benzoate，EB，11 mg/kg/d)，連續(xù)注射4 d可得；外源性膽汁淤積大鼠模型的建立：實(shí)驗(yàn)前Wistar大鼠禁食12 h，經(jīng)乙醚麻醉后，迅速固定，上腹正中切口(約3 cm)開腹，暴露肝門，游離膽總管，用眼科剪于膽總管中上1/3處剪“V”字形口，插入引流管(腰麻管)，0號(hào)手術(shù)線雙重結(jié)扎固定引流管，鈍性分離大鼠腹部皮下隧道至頸部，開口，引流管過皮下隧道至頸外固定，遠(yuǎn)端結(jié)扎5d，于第6 d

3、再通(即剪開引流管遠(yuǎn)端結(jié)扎處)，再通3 d后獲得外源性膽汁淤積大鼠模型。
　　 2.CPZ的藥動(dòng)學(xué)研究：將Wistar大鼠分為正常對(duì)照組，內(nèi)源性膽汁淤積模型組；溶媒對(duì)照組(皮下注射等體積的橄欖油)；外源性膽汁淤積模型組；假手術(shù)組(大鼠被開腹，游離膽管后關(guān)腹)；灌胃茵梔黃顆粒3 d/7 d內(nèi)源性膽汁淤積組；灌胃生理鹽水3 d/7 d內(nèi)源性膽汁淤積模型組；灌胃茵梔黃顆粒7 d外源性膽汁淤積組；灌胃生理鹽水7 d外源性膽汁淤積模型組。

4、各組大鼠在給予CPZ前進(jìn)行膽管插管術(shù)(外源性膽汁淤積模型組除外)和股動(dòng)脈插管手術(shù)，待大鼠恢復(fù)清醒狀態(tài)后，通過股靜脈給大鼠瞬間注射CPZ生理鹽水溶液(20 mg/Kg)，采集不同時(shí)間點(diǎn)的血樣、收集不同時(shí)間段的膽汁，用含有內(nèi)標(biāo)的葛根素甲醇溶液(20μg/mL)沉淀蛋白。采用Cosmosil Ci8色譜柱(5μm，4.6×150 mm)，以甲醇-0.03 mol/L醋酸銨緩沖液(20∶80 v/v)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為2

5、70nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL的色譜條件測(cè)定CPZ在大鼠膽汁和血液中的濃度，并用DAS1.0軟件估算相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果：1.內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型的進(jìn)食量，體重及活動(dòng)量均明顯減少，且其生化指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic pyruvic transaminase，ALT)、總膽紅素(Total bilirubin，TB

6、IL)、直膽紅素(Direct bilirubin，DBIL)、總膽汁酸(Total bile acids，TBA)及堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)顯著升高，而白蛋白(Albumin，ALB)和膽固醇(Cholesterol，CHOL)顯著降低。外源性膽汁淤積大鼠模型的雙耳、眼球及尾巴均明顯黃染，尿液變黃，其肝臟腫脹，包膜張力變大，邊緣鈍厚，色澤暗紅，其組織病理切片可見毛細(xì)膽管擴(kuò)張，肝血竇變窄，匯管區(qū)毛細(xì)

7、膽管大量增加等現(xiàn)象，再通手術(shù)后，其肝臟組織漸漸恢復(fù)正常，但有個(gè)別大鼠的肝組織出現(xiàn)了局部硬化的現(xiàn)象。內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型未見雙耳、眼球和尾巴的黃染，但尿液變黃，其肝臟腫脹并黃染，有淤血現(xiàn)象，且組織病理切片可見肝內(nèi)膽管有所增生，肝細(xì)胞排列紊亂，小葉間質(zhì)炎癥等現(xiàn)象。
　　 2.CPZ的血漿樣品和膽汁樣品在0.16～160μg/mL濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)線性方程分別為Y=0.1703X+0.0019和Y'_0.1404 X'+0.0011，

8、其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9993和0.9996；血漿樣品的日內(nèi)、日間回收率均大于92.42％，精密度RSD均小于9.55％；膽汁樣品的日內(nèi)、日間回收率均大于91.22％，精密度RSD均小于8.06％。
　　 3.CPZ在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為較正常大鼠組發(fā)生了顯著變化，其在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的血藥濃度顯著增加而膽藥濃度顯著降低(P＜0.01)，且CPZ在內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠體內(nèi)經(jīng)膽汁排泄的量較正

9、常大鼠分別降低28.58％和59.23％，而其半衰期t1/2和平均滯留時(shí)間(Meanresidence time，MRT)顯著增加(P＜0.01)，而系統(tǒng)清除率(Systemic clearance，CLsys)和膽汁清除率(Bile clearance，CLbile)顯著降低(P＜0.01)。
　　 4.CPZ在茵梔黃顆粒治療7 d的內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為與灌胃7 d生理鹽水內(nèi)源性膽汁淤積大鼠模型的藥動(dòng)學(xué)學(xué)行為

10、存在顯著性差異，其t1/2分別為0.385±0.016 h和0.526±0.17 h(P＜0.01)；其MRT分別為0.472±0.098 h和0.6530.131 h(P＜0.01)。但CPZ在茵梔黃顆粒治療7 d的外源性膽汁淤積大鼠模型體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為與灌胃7 d生理鹽水外源性膽汁淤積大鼠模型的藥動(dòng)學(xué)行為間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)通過大鼠頸部皮下注射EB和膽道梗阻-再通手術(shù)分別獲得了典型的內(nèi)/

11、外源性膽汁淤積大鼠模型。
　　 2.肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp2在膽汁淤積大鼠模型肝臟上的表達(dá)顯著降低，使CPZ不能被順利排入膽汁，導(dǎo)致了CPZ在膽汁淤積大鼠體內(nèi)經(jīng)膽汁排泄的量顯著降低，在血液循環(huán)中的濃度顯著升高，使系統(tǒng)清除率也隨之降低。
　　 3.茵梔黃顆粒作為臨床上常用的治療黃疸的輔助用藥，灌胃給予內(nèi)/外源性膽汁淤積大鼠模型7d后，根據(jù)CPZ的藥動(dòng)學(xué)行為變化初步推測(cè)茵梔黃顆粒的退黃作用機(jī)制之一可能是改變了Mrp2的表達(dá)或