肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子的篩選與鑒定.pdf

1、肝內(nèi)膽汁淤積是多種肝病的重要病理改變，其可以加重肝臟損害，加速肝硬化、肝功能衰竭的進程。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，各種原因導致的肝炎患者一旦合并有肝內(nèi)膽汁淤積，則病情進展速度加快，短期內(nèi)即可進展到肝硬化期，甚至發(fā)展為重癥肝炎，肝功能衰竭而死亡，治療上非常困難，常無有效的治療措施。 目前研究認為，肝臟對代謝產(chǎn)物或異物的排泄是通過分布在肝細胞膽管膜側的轉動體來完成的，這種轉運是耗能的，需要ATP 的參與。這被認為是代謝產(chǎn)物或異物排出肝細胞的

2、終末環(huán)節(jié)。有學者也將這一環(huán)節(jié)稱為肝細胞的第Ⅲ相反應。第Ⅲ相反應異?？赡苁歉蝺?nèi)膽汁淤積性肝病最重要的發(fā)病機制。 因此，肝細胞膽管側細胞膜膽汁排泄相關分子的研究也成為肝內(nèi)膽汁淤積性肝病領域的研究熱點。近年來，雖然在肝細胞膽管側細胞膜陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些與膽汁排泄相關的分子，明確了一些疾病的病因及發(fā)病機制，使一些肝內(nèi)膽汁淤積疾病得到了及時診斷及治療，然而，發(fā)現(xiàn)的這些分子還遠不能解決所有肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的問題。 因此，建立具有功能的

3、肝細胞膽管膜側體外轉運模型，發(fā)現(xiàn)肝細胞膽管側細胞膜上新的轉運相關分子，對于進一步明確肝臟的復雜生理功能及肝內(nèi)膽汁淤積性肝病發(fā)病機理至關重要。 實驗目的：分離肝細胞膽管側細胞膜和血竇側細胞膜，建立具有功能的肝細胞膽管膜側體外轉運模型，篩選與鑒定大鼠肝細胞膽管側細胞膜上轉運相關分子。 材料和方法： 1．大鼠肝細胞膽管側細胞膜的提取與鑒定 （1）以percoll 和蔗糖溶液為密度梯度介質，利用密度梯度離心法分離

4、大鼠肝細胞膽管側膜小體(CMV) 和血竇側膜小體(SMV) ； （2）通過SDS-PAGE、酶學分析和透射電鏡掃描對之性質進行進一步鑒定； （3）以Mrp2特異性轉運物質E217βG 為轉運底物，利用轉運試驗觀察CMV 的轉運活性。 2．大鼠肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子抗體的篩選 （1）以大鼠肝細胞膽管側膜小體為免疫原，免疫BALB/C 小鼠，進行單克隆抗體的制備； （2）利用比較ELISA 法

5、、免疫組化和體外轉運試驗篩選抗大鼠肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子的抗體； （3）用腹水制備法大量制備單克隆抗體，并用飽和硫酸銨法進一步純化抗體； （4）利用抗體亞類和亞型檢測試劑盒對抗體進行亞類和亞型的檢測； （5）利用Western blot 對篩選到的抗體所識別的目的蛋白進行分子量的鑒定。 3. 大鼠肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子的抗原鑒定 (1) 利用雙向電泳，進一步鑒定抗體所識別抗原的理

6、化性質； （2）利用免疫沉淀，雙向電泳，Western blot 等技術獲取抗體所識別抗原的蛋白條帶； （3）利用肽指紋圖譜測序，數(shù)據(jù)庫軟件分析的方法分析蛋白條帶，初步明確抗體所識別抗原的蛋白質信息。 結果： 1．大鼠肝細胞膽管側細胞膜的提取與鑒定情況 以percoll 和蔗糖溶液為密度梯度介質，利用密度梯度離心法成功地提取出了大鼠肝細胞膽管側膜小體(CMV)和血竇側膜小體(SMV)，SDS-PA

7、GE 結果顯示：分離的肝細胞膜蛋白與肝細胞勻漿蛋白存在著明顯蛋白條帶的差異；同時肝細胞膽管側細胞膜和血竇側細胞膜也有一些蛋白條帶的不同。堿性磷酸酶是肝細胞膽管側細胞膜的標志物，Na+-K+ ATPase 則是肝細胞血竇側細胞膜的標志物。堿性磷酸酶和Na+-K+ ATPase 特異性酶學分析顯示：CMV 的堿性磷酸酶活性是SMV 的5.2 倍，而SMV 的Na+-K+ ATPase 活性是CMV 的5.7 倍，有顯著統(tǒng)計學差異。透射電鏡掃

8、描：CMV 和SMV，為大小均一，直徑約450nm 的膜性囊泡。體外轉運實驗證實：分離得到的CMV 具有轉運活性。 2．大鼠肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子抗體的篩選 以提取的大鼠肝細胞膽管側膜小體為免疫原，免疫BALB/C 小鼠，通過多次融合，利用比較ELISA 法、獲得了46 株在大鼠肝細胞膽管側細胞膜高表達分子的單克隆抗體。免疫組化組織定位結果顯示：所得到的46 株抗體在大鼠肝組織中的表達分布不盡相同。其中一株單克隆

9、抗體特異性地定位于大鼠肝細胞膽管側細胞膜上，命名為cm1,抗體亞類和亞型為IgG2a/κ型。Westernblot 定量分析，也證實其在肝細胞膽管側細胞膜表達量明顯高于血竇側細胞膜的表達量，其所識別抗原的分子量約為140kDa。另外，有兩株抗體在肝組織中表達呈特異性分布。一株抗體在大鼠肝小葉中央靜脈周圍肝實質細胞中的表達明顯高于在肝小葉的匯管區(qū)周圍肝實質細胞中的表達，命名為cv1；有趣的是cv1 在人肝臟組織中表達在肝細胞的血竇側細胞膜

10、上以及肝血竇腔某種肝非實質細胞中，而在人和鼠肝組織中其所識別抗原的分子量均約為25kDa。另一株抗體特異性地表達在肝細胞核膜上，命名為nm1，其所識別抗原的分子量約為50kDa。有關這46 株抗體的體外轉運功能篩選還在進一步的進行中。 3. 大鼠肝細胞膽管側細胞膜轉運相關分子的抗原鑒定 我們首先對cm1、cv1 和nm1 這3 株抗體所識別的抗原進行了進一步的鑒定。免疫沉淀、肽指紋圖譜測序結果提示：cm1 可能是一種新的

11、表達在大鼠肝細胞膽管側細胞膜上的特異性分子。雙向電泳、Western blot 結果顯示，cv1 識別抗原的等電點約為3-4；nm1 抗體所識別的抗原為ATP 合成亞單位β（ATPB）。 結論： 我們首次在國內(nèi)利用密度梯度離心法成功分離出了大鼠肝細胞膽管側細胞膜和血竇側細胞膜，建立了具有功能的肝細胞膽管膜側體外轉運模型。該模型的建立，為進一步明確已知轉運相關分子的生理功能及發(fā)現(xiàn)新的轉運相關分子提供了有利的工具和手段，隨著

12、該模型的廣泛應用，將為進一步明確肝臟復雜的生理功能及肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的發(fā)病機制奠定良好的基礎。利用提取的大鼠肝細胞膽管側膜小體為免疫原，通過比較ELISA 法，篩選獲得了46 株在大鼠肝細胞膽管側細胞膜高表達分子的單克隆抗體。其中，一株單抗特異性地結合在肝細胞膽管膜側，我們將其命名為cm1，經(jīng)免疫沉淀及肽指紋質譜測序，與已知轉運分子進行比較分析，推測其可能為轉運相關的新分子。第二株單抗，特異性地結合在大鼠肝小葉中央靜脈周圍肝實質細胞胞