2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、胎兒器官成熟特別是肺成熟與分娩發(fā)動(dòng)是一個(gè)協(xié)同進(jìn)行的過程,而這一過程依賴于妊娠晚期內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的增加。由于人類胎兒腎上腺的特殊結(jié)構(gòu)和胎盤糖皮質(zhì)激素屏障的存在,妊娠晚期胎兒組織11β-羥基類固醇脫氫酶I型(11β-Hydroxysteroiddehydrogenasetype1,11β-HSDl)對(duì)17-羥-11-脫氫皮質(zhì)酮的活化作用可能成為胎兒體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的重要來源。目前已有充分證據(jù)表明,大多數(shù)動(dòng)物胎兒肺能夠表達(dá)11β-HSD1,而

2、且11β-HSDl。小鼠肺成熟出現(xiàn)障礙,提示11β-HSDl在胎兒肺成熟中的關(guān)鍵作用,但人胎兒組織特別是肺是否表達(dá)-11β-HSDl目前還不明了。以往研究發(fā)現(xiàn),人胎膜表達(dá)的11β-HSD1也為胎兒器官成熟提供重要的糖皮質(zhì)激素來源,糖皮質(zhì)激素和促炎性細(xì)胞因子作為抑炎和促炎的兩種因子卻都可以誘導(dǎo)胎膜11βHSDl的表達(dá),但其分子機(jī)制目前尚未闡明。本課題采用免疫組織化學(xué)、常規(guī)PCR、Westernblotting、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶活性測(cè)

3、定、啟動(dòng)子克隆與活性測(cè)定、功能蛋白過表達(dá)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)等技術(shù),首先研究了人胎兒肺組織是否表達(dá)11β-HSDl,然后分別以人胎兒肺成纖維細(xì)胞株(HFL-1)和原代培養(yǎng)人羊膜成纖維細(xì)胞為研究模型,研究了促炎性細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-1β)和糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)誘導(dǎo)11β-HSDl表達(dá)的分子機(jī)制。
  主要研究結(jié)果
  1.常規(guī)PCR和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,妊娠中期(孕4個(gè)月)和晚期(

4、孕8個(gè)月)人胎肺組織中都能夠檢測(cè)到11β-HSD1Mrna,但只在妊娠晚期胎肺組織中檢測(cè)到11β-HSDl的分布,包括小支氣管和細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞和小支氣管間質(zhì)細(xì)胞。此外,在HFL-1細(xì)胞中也檢測(cè)到了11β-HSD1mRNA和蛋白,而且用Westernblotting和酶活性測(cè)定的方法證實(shí)了上述結(jié)果。此結(jié)果不但提示胎兒肺組織至少在妊娠晚期可以表達(dá)11β-HSD1蛋白,而且也提示HFL-1細(xì)胞是進(jìn)一步研究胎兒肺11β-HSD1表達(dá)調(diào)控的良

5、好實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?.以HFL-1細(xì)胞和原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞為研究模型,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblotting和酶活性測(cè)定等方法研究發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇增加11βHSD1Mrna和蛋白水平的現(xiàn)象同時(shí)存在于HFL-1細(xì)胞和原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞中。
  3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果表明,白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇對(duì)人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞11β-HSD1Mrna表達(dá)的誘導(dǎo)作用能夠被Mrna轉(zhuǎn)錄抑制

6、劑DRB和蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX阻斷,提示白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇增加11β-HSD1mRNA水平的作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平并需要蛋白質(zhì)合成的參與。用表達(dá)拮抗C/EBP蛋白的質(zhì)粒(CMV-500-A-C/EBP)轉(zhuǎn)染HFL-1細(xì)胞和人羊膜成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11β-HSDlMrna表達(dá)作用均可以被不同程度阻斷,提示在上述兩種細(xì)胞中C/EBPs家族成員均參與了白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11β-HSD1Mrna表達(dá)作用。

7、
  4.我們以HFL-1細(xì)胞為模型進(jìn)一步研究了白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)11β-HSD1Mrna表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果表明:(1)NF-Kb轉(zhuǎn)錄激活抑制劑5HPP-33不能阻斷白細(xì)胞介素-1β對(duì)HFL1細(xì)胞11β-HSD1Mrna表達(dá)的誘導(dǎo)作用,但能夠阻斷白細(xì)胞介素-1β對(duì)炎癥介質(zhì)前列腺素合成酶COX-2Mrna的誘導(dǎo)作用,提示白細(xì)胞介素-1β對(duì)11β-HSD1Mrna表達(dá)的促進(jìn)作用與此經(jīng)典的炎癥通路無關(guān)。(2)將11β-HSD1啟動(dòng)子

8、克隆并構(gòu)建于報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HFL-1細(xì)胞后測(cè)定其啟動(dòng)子活性發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素-1β能夠促進(jìn)11βHSDl啟動(dòng)子活性增加,此作用可以被CCAAT序列突變所阻斷。(3)Westernblotting分析結(jié)果表明,HFL-1細(xì)胞中主要表達(dá)C/EBPβ而幾乎不表達(dá)C/EBPα,白細(xì)胞介素-1β強(qiáng)烈誘導(dǎo)C/EBPβ的表達(dá)。(4)進(jìn)一步用ChIP和EMSA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),白細(xì)胞介素11β促進(jìn)C/EBPβ與11β-HSD1啟動(dòng)子CCAAT序列的結(jié)合。

9、(5)轉(zhuǎn)染表達(dá)C/EBPβ質(zhì)粒(pMSV-C/EBPβ)和表達(dá)拮抗C/EBP蛋白的質(zhì)粒(CMV-500-A-C/EBP)分別可以模擬和阻斷白細(xì)胞介素-1β對(duì)11β-HSD1表達(dá)的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果提示,白細(xì)胞介素-lp主要通過C/EBPβ誘導(dǎo)HFL-1細(xì)胞11β-HSD1的表達(dá)。
  5.我們以原代培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞為模型進(jìn)一步研究了皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11β-HSD1Mrna表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果表明:(1)皮質(zhì)醇對(duì)11β-HSD1mR

10、NA表達(dá)的誘導(dǎo)作用能夠被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486阻斷,提示皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11β-HSD1表達(dá)的作用需要糖皮質(zhì)激素受體的參與。(2)將11β-HSD1啟動(dòng)子-報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后測(cè)定其啟動(dòng)子活性發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇能夠促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞11β-HSDl啟動(dòng)子活性增加,此作用可以分別被糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)和CCAAT序列突變所削弱。(3)Westernblotting分析結(jié)果表明,人羊膜成纖維細(xì)胞中主要表達(dá)C/EBPa而少量表達(dá)C/E

11、BPβ,皮質(zhì)醇對(duì)人羊膜成纖維細(xì)胞C/EBPα表達(dá)的誘導(dǎo)作用比較明顯。(4)進(jìn)一步用ChIP和EMSA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇促進(jìn)Gra和C/EBPa分別與11β-HSDl啟動(dòng)子的GRE和CCAAT序列的結(jié)合。(5)轉(zhuǎn)染CMV-500-A-C/EBP質(zhì)??梢韵魅跗べ|(zhì)醇對(duì)11β-HSDl表達(dá)的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果提示,糖皮質(zhì)激素受體和C/EBPa都參與了皮質(zhì)醇對(duì)人羊膜成纖維細(xì)胞11β-HSDl表達(dá)的誘導(dǎo)作用。結(jié)論
  本課題研究結(jié)果表明,妊

12、娠晚期人胎肺組織中表達(dá)11β-HSDl:白細(xì)胞介素-1β與皮質(zhì)醇誘導(dǎo)11βHSD1基因表達(dá)的現(xiàn)象同時(shí)存在于HFL-1細(xì)胞和人羊膜成纖維細(xì)胞。皮質(zhì)醇主要通過促進(jìn)糖皮質(zhì)激素受體Gra和C/EBPa分別與11β-HSD1基因啟動(dòng)子糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件和C/EBP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合誘導(dǎo)人羊膜成纖維細(xì)胞11β-HSDl基因表達(dá);白細(xì)胞介素-1β主要通過促進(jìn)C/EBPβ與11β-HSDl基因啟動(dòng)子上C/EBP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合誘導(dǎo)HFL-1細(xì)胞11β-HSD

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