黃芩苷干預(yù)人肺成纖維細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：用不同濃度的黃芩苷干預(yù)體外培養(yǎng)的人肺成纖維化細(xì)胞，觀察中藥單體黃芩苷對人肺成纖維細(xì)胞中CTGF、FN、ILK、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白mRNA以及蛋白表達(dá)水平的影響，探討中藥單體黃芩苷抑制人肺成纖維細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)人肺成纖維細(xì)胞，傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)為2×105，分為5組：空白組，醋酸潑尼松組，黃芩苷高濃度組，黃芩苷中濃度組和黃芩苷低濃度組，醋酸潑尼松組加入1mM，黃芩苷高、中、低濃度組分別加入10mM、5mM、1

2、mM藥液，在CO2孵箱中培養(yǎng)24h、48h、72h，MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率；采用分子生物學(xué)技術(shù)RT-PCR和western blot分別檢測細(xì)胞中CTGF、FN、ILK、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白mRNA以及蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法檢測黃芩苷干預(yù)人肺成纖維細(xì)胞增殖抑制率
　　不同濃度黃芩苷（10mM、5mM、1mM）干預(yù)HFL1細(xì)胞72h后，細(xì)胞增殖抑制率的結(jié)果，醋酸潑尼松組增殖抑制率為82％，黃芩苷高

3、濃度組增殖抑制率為74%，中濃度組增殖抑制率為54%，低濃度組增殖抑制率為28%。MTT法結(jié)果表明，黃芩苷對HFL1細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，該作用具有濃度依賴性。當(dāng)終濃度達(dá)到10mM以上時(shí)，細(xì)胞增殖抑制明顯，同空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.黃芩苷對HFL1細(xì)胞CTGF、ILK、FN、Ⅰ和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平影響
　　2.1.CTGF mRNA的表達(dá)水平
　　在醋酸潑尼松的干預(yù)下，同空白組

4、相比，醋酸潑尼松組在HFL1細(xì)胞中CTGF mRNA表達(dá)水平明顯下降，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；在黃芩苷的干預(yù)下，高、中、低濃度組在HFL1細(xì)胞中CTGF mRNA表達(dá)水平均下降，高濃度組與空白組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，黃芩苷中、低濃度組與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；黃芩苷高濃度組與醋酸潑尼松組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，中濃度

5、組與低濃度組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，高濃度組與低濃度組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　2.2.FN mRNA的表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中FN mRNA表達(dá)水平明顯下降，與空白組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；黃芩苷高濃度組與中、低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；低濃度組

6、與中濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.3.ILK mRNA的表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中ILK mRNA表達(dá)水平明顯下降，與空白組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；黃芩苷高濃度組與中、低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中濃度組與低濃度組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

7、P<0.01)。
　　2.4.Ⅰ型膠原蛋白 mRNA的表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白 mRNA表達(dá)水平明顯下降，黃芩苷高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組與空白組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　黃芩苷高濃度組與醋酸潑尼松組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；黃芩苷中濃度組與醋酸潑尼松組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；黃芩苷低濃度組與醋酸潑

8、尼松組相比，黃芩苷高濃度組與低濃度組相比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；低濃度組與中濃度組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　2.5.Ⅲ型膠原蛋白 mRNA的表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中Ⅲ型膠原蛋白 mRNA表達(dá)水平明顯下降，與空白組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.0

9、1)。高濃度組與中濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；中濃度組與低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　3.黃芩苷對HFL1細(xì)胞CTGF、ILK、FN、Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白水平表達(dá)的研究
　　3.1.CTGF蛋白表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中CTGF蛋白表達(dá)水平明顯下降，與空白組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、差異(P<0.01)；高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　黃芩苷高濃度組與中濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中濃度組與低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　3.2.ILK蛋白表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)水平均有下降，黃芩苷高濃度組

11、、醋酸潑尼松組與陰性對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中濃度組與陰性對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；低濃度組與陰性對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與中濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；中濃度組和低濃度組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　3

12、.3.FN蛋白表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中FN蛋白表達(dá)水平均有下降，黃芩苷高、中濃度組、醋酸潑尼松組與空白組相比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；低濃度組與空白組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與中濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與低濃度組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0

13、.01)；中濃度組和低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　3.4.I型膠原蛋白表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中I型膠原蛋白表達(dá)水平均有下降，黃芩苷高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組與空白組相比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　黃芩苷高、中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與低濃度組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

14、01)；高濃度組與中濃度組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；中濃度組和低濃度組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　3.5.II型膠原蛋白表達(dá)水平
　　在黃芩苷和醋酸潑尼松干預(yù)下，高、中、低濃度組、醋酸潑尼松組HFL1細(xì)胞中III型膠原蛋白表達(dá)水平均有下降，與空白組相比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；高濃度組與醋酸潑尼松組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；中、低濃度組與醋酸潑尼松組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01

15、)；高濃度組和中濃度組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；高濃度組和低濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)；中濃度組和低濃度組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、加藥連續(xù)干預(yù)HFL1細(xì)胞72h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)醋酸潑尼松組對細(xì)胞的增殖抑制率最高，黃芩苷高濃度組對細(xì)胞的增殖抑制率較高，黃芩苷中濃度組次之，黃芩苷低濃度組幾乎對細(xì)胞無影響。且隨時(shí)間延長，細(xì)胞增殖抑制效果明顯。
　　2、黃