廣州管圓線蟲感染長爪沙鼠動物模型的實驗研究.pdf

1、廣州管圓線蟲主要流行于太平洋島嶼和東南亞地區(qū)如泰國、越南、馬來西亞、日本、印度、菲律賓等國家。近年來，該蟲的感染呈擴散趨勢，不斷有新的疫區(qū)出現(xiàn)，此外如瑞士、美國、澳大利亞等國家也有感染病例的報道。到目前為止，全球已有超過3000例人體病例的報道，其重要性已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界的重視。廣州管圓線蟲主要侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎（EM）。一個良好的動物模型對于了解寄生蟲的致病機理、宿主的抗感染免疫、疾病的實驗室診

2、斷和藥物篩選研究至關(guān)重要。目前，廣州管圓線蟲感染在體實驗研究多是選用大鼠或小鼠，但它們作為感染模型動物自身都存在一定的局限性，且不能正確反映兒童和免疫力較低下人群感染后廣州管圓線蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育過程和人體組織病變特點，所以有開發(fā)一種新的動物模型用于廣州管圓線蟲感染研究的需要。長爪沙鼠作為一種小型“多功能實驗動物”，具有經(jīng)濟(jì)、使用方便、易飼養(yǎng)等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛的被用作多種寄生蟲感染的實驗動物。因此，本研究對長爪沙鼠作為廣州管圓線蟲感染模型

3、動物的可能性進(jìn)行了探討。
　　研究目的：以廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲感染的長爪沙鼠為研究對象，通過對該蟲在長爪沙鼠體內(nèi)的生長發(fā)育、組織分布、病理改變、血清特異性IgG抗體水平的動態(tài)變化和抗蠕蟲藥物治療效果等方面的研究，以探討其作為廣州管圓線蟲新的感染動物模型的可能性和特點。
　　研究方法：
　　1、從褐云瑪瑙螺中分離和獲取廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲。
　　2、動物感染
　?、賹㈤L爪沙鼠隨機分為3組，包括感染組1、感

4、染組2和感染組3。每組各20只長爪沙鼠，3組經(jīng)腹腔注射感染廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲，感染蟲體數(shù)分別為：35條幼蟲/鼠、15條幼蟲/鼠、10條幼蟲/鼠。另設(shè)未感染的長爪沙鼠20只作為對照。觀察至感染后第32 d。
　?、趯㈤L爪沙鼠分為對照組和實驗組，對照組20只長爪沙鼠，實驗組50只長爪沙鼠。其中對照組經(jīng)腹腔注射生理鹽水；實驗組經(jīng)腹腔注射感染廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲，10條幼蟲/鼠。觀察至感染后第46 d。
　　③將廣州管圓線蟲第

5、Ⅲ期幼蟲經(jīng)腹腔注射感染24只長爪沙鼠，15條幼蟲/鼠。于感染后第7 d將感染長爪沙鼠隨機分成未治療組和治療組（阿苯達(dá)唑），每組均為12只長爪沙鼠。
　　3、對感染敏感性的觀察觀察感染后各組長爪沙鼠的生理學(xué)變化和病理學(xué)改變；記錄各組長爪沙鼠的存活及死亡情況，以了解長爪沙鼠對廣州管圓線蟲感染的敏感性、耐受性和適宜的實驗感染蟲數(shù)。
　　4、實驗組感染情況的觀察
　　①一般行為和死亡情況的觀察按上述方法3進(jìn)行。
　?、谑?/p>

6、體內(nèi)蟲體的檢查、蟲體的組織分布和形態(tài)觀察分別在感染后不同時間點剖殺部分實驗組的長爪沙鼠，檢查在實驗過程中死亡的感染長爪沙鼠；在第46 d剖殺對照組和實驗組存活的長爪沙鼠。除少部分鼠的腦、肺組織用于直接固定和病理切片檢查外，對其余長爪沙鼠分離的腦和肺組織，撕碎后用肉眼或顯微鏡查找廣州管圓線蟲蟲體。記錄各組織中所檢獲的雌雄蟲體數(shù)量，并測量蟲體大小和觀察蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　?、劢M織病理變化觀察檢查感染后不同時間長爪沙鼠的腦和肺組織，肉眼觀

7、察其組織病理變化特點；將本實驗部分長爪沙鼠腦和肺組織制作石蠟切片，用于其病理變化的鏡下觀察。
　?、芗S便檢查在感染后的第45 d，用生理鹽水直接涂片法在顯微鏡下對實驗組和對照組所有存活的長爪沙鼠糞便進(jìn)行檢查。
　　⑤長爪沙鼠血清特異性IgG抗體動態(tài)變化采集對照組和實驗組長爪沙鼠感染后不同時間的血清，用廣州管圓線蟲成蟲粗抗原包被96孔ELISA板，采取間接ELISA方法檢測長爪沙鼠血清中特異性IgG抗體的水平及分析其動態(tài)變化。

8、
　　5、藥物治療效果的觀察實驗于感染后第8 d對治療組長爪沙鼠經(jīng)灌胃給予阿苯達(dá)唑，連續(xù)給藥3 d，未治療組只給予蒸餾水。觀察并記錄兩組長爪沙鼠的存活情況，同時對死亡的未治療組沙鼠進(jìn)行檢查。在感染后第26 d剖殺所有存活的此兩組長爪沙鼠，取腦和肺組織，觀察和比較其病理變化，查找并計數(shù)蟲體，比較兩組之間的差異。
　　研究結(jié)果：
　　1、對感染敏感性的觀察
　?、倥c未感染的對照組比較，長爪沙鼠在感染后先表現(xiàn)為精神萎靡

9、、食欲減退，后出現(xiàn)脊柱側(cè)彎、步態(tài)不穩(wěn)、打轉(zhuǎn)和癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀。
　　②三組長爪沙鼠大約在感染后第22 d開始出現(xiàn)死亡。感染組1、感染組2和感染組3，50％感染沙鼠死亡的時間分別約為感染后第26 d，27 d和第28 d。至感染后第30 d上述三組的死亡率分別約為85%、75%和60%。此外，體重較大者死亡率較低。而對照組長爪沙鼠未出現(xiàn)死亡，且攝食和活動正常。
　?、坶L爪沙鼠對廣州管圓線蟲感染極為敏感，且耐受感染的能力較

10、差。因此，本研究選擇以10條幼蟲/鼠進(jìn)行感染。
　　2、實驗組感染情況的觀察
　?、僖话銧顩r：實驗組長爪沙鼠在感染后第8 d就開始有不同程度的萎靡、活動減少、食欲減退等癥狀；約第16 d有一部分長爪沙鼠出現(xiàn)毛發(fā)倒豎、脊柱側(cè)彎、閉眼、不活動等癥狀；感染后第17～18 d，部分長爪沙鼠出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、打轉(zhuǎn)和偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并且隨著時間的推移，出現(xiàn)這些癥狀的長爪沙鼠的數(shù)量在不斷增加，它們的癥狀也逐漸加重，而且還出現(xiàn)了不同程度的飲

11、水和進(jìn)食困難。而對照組長爪沙鼠一般狀況良好，攝食活動正常。
　?、谒劳銮闆r：在感染后第22 d就開始出現(xiàn)長爪沙鼠死亡，死亡的高峰時間為感染后的第23～30 d。至感染結(jié)束時，除了剖殺和死亡外，實驗組最終有12只長爪沙鼠生存至感染后第46 d；而對照組長爪沙鼠未出現(xiàn)死亡。
　　③蟲體檢查：實驗組長爪沙鼠于感染后第7 d在腦和肺組織中均未能檢獲到蟲體；感染后第22～46 d之間共檢查長爪沙鼠35只（包括死亡鼠），從其腦和肺組織中

12、共檢獲蟲體127條（♀62/♂65），蟲體收獲率約為36.29%（127/350），平均蟲數(shù)為3.63±1.46/鼠。感染后第23～30 d檢獲蟲體數(shù)最多。對照組長爪沙鼠的腦和肺組織均未檢獲到廣州管圓線蟲。
　?、芟x體組織分布：在實驗組感染長爪沙鼠中，感染后第22～25 d80%以上的蟲體集中在腦，約20%在肺；感染后第30～35 d40%的蟲體在腦，而60%的蟲體在肺；感染后第41～46 d大約10%的蟲體在腦，而90%以上的蟲

13、體在肺。
　?、萁M織病理變化：肉眼觀察顯示，實驗組長爪沙鼠感染后第7 d腦組織的病理變化不太明顯。感染后第10 d，腦組織表面可出現(xiàn)較明顯的充血。感染后第23 d，長爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹?，腦組織水腫，表面有不同程度的充血、出血、血管擴張與粘連；而肺部組織呈彌漫性充血改變。感染后第30～46 d，以肺部病變?yōu)橹?，肺組織有不同程度的局灶性充血腫脹，表面及切面質(zhì)硬粗糙呈灰白色顆粒狀，還可見到點狀、小片狀出血灶；而腦組織只有局限性血管擴張

14、和充血。病理切片鏡下觀察結(jié)果顯示，感染后第27 d，在切片中可見到腦膜增厚、邊緣粗糙，蛛網(wǎng)膜下腔有蟲體，蟲體周圍有出血，而且還有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；感染后第39 d，肺內(nèi)可見多個橢圓形廣州管圓線蟲蟲卵，蟲卵為多細(xì)胞期或幼蟲期；病灶處肺泡輪廓大部消失，且有大量滲出和炎癥細(xì)胞浸潤，呈以蟲卵為中心的肉芽腫性炎癥改變。
　　⑥糞便檢查和對應(yīng)的蟲體寄生情況：在感染后第45 d，對實驗組12只長爪沙鼠進(jìn)行糞便檢查，從4只沙鼠糞便中發(fā)現(xiàn)廣

15、州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲，約占1/3。從上述12只長爪沙鼠的肺動脈中均能檢獲到蟲體，有6只長爪沙鼠為雌雄蟲寄生，在這6只長爪沙鼠中有4只糞便可以查到廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲，其中2份糞便在鏡下可見到大量幼蟲，而另外2份糞便幼蟲較少（均為1條/片）；另外6只長爪沙鼠為肺部單性蟲體寄生，在它們的糞便中均未查到廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲。而對照組的長爪沙鼠糞便中未查到Ⅰ期幼蟲。
　?、哐逄禺愋訧gG抗體的動態(tài)變化：長爪沙鼠血清中特異性IgG抗體水平于

16、感染后第7 d時就已經(jīng)開始輕微升高，在感染后的第30 d達(dá)到高峰，隨后在第37d和45 d水平又呈下降趨勢。且從感染后第15 d開始OD值實驗組/對照組＞2.1。
　　3、藥物治療效果的觀察:在感染后第26 d，未治療組長爪沙鼠均能檢獲到蟲體，且都有廣州管圓線蟲感染所致的癥狀；而治療組均未能檢獲到蟲體，亦無相應(yīng)的癥狀出現(xiàn)。治療組腦和肺組織病理變化不明顯；而未治療組腦組織表面可見不同程度的充血、出血、血管擴張及粘連，肺部也呈彌漫性充

17、血腫脹。
　　結(jié)論：
　　1、不同的感染蟲數(shù)，長爪沙鼠的死亡率不同。感染蟲數(shù)越多，其出現(xiàn)癥狀越早，死亡率也越高。廣州管圓線蟲感染長爪沙鼠以10條幼蟲/鼠感染較好，如果感染研究觀察時間在25 d以內(nèi)，也可考慮用15條幼蟲/鼠或更大蟲數(shù)進(jìn)行感染。
　　2、長爪沙鼠介于廣州管圓線蟲的適宜宿主和非適宜宿主之間，且對廣州管圓線蟲感染非常敏感。
　　3、感染后30 d前，長爪沙鼠以腦部病變?yōu)橹鳎?0 d后，以肺部病變?yōu)橹?。?/p>