人鼠嵌合肝動(dòng)物模型及其感染HBV的初步研究.pdf

1、肝臟是最早進(jìn)行細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)的器官之一.人肝細(xì)胞移植是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域,它不但可作為有效的治療手段,而且利用人肝細(xì)胞異種移植建立動(dòng)物模型對(duì)于研究病毒感染性肝病大有裨益.異種肝細(xì)胞移植到具有免疫活性的嚙齒動(dòng)物體內(nèi)會(huì)因宿主免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞激活和遲發(fā)性超敏反應(yīng)而排斥供體細(xì)胞.要克服異種移植引發(fā)的排斥反應(yīng)可選用無免疫活性的小鼠作為受者,或是誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)移植物的特異耐受.免疫系統(tǒng)具有重要的識(shí)別功能,即識(shí)別自己和異己.對(duì)自身組織細(xì)胞產(chǎn)生耐受

2、,而對(duì)非己組織細(xì)胞識(shí)別后,引起有效的免疫應(yīng)答,通過排斥反應(yīng),從體內(nèi)消除異己物質(zhì).實(shí)驗(yàn)證明,動(dòng)物在胚胎發(fā)育時(shí)期接觸到外來抗原會(huì)逐漸對(duì)這些抗原產(chǎn)生免疫耐受,出生后允許異種移植物在體內(nèi)存活.該課題采用誘導(dǎo)胎鼠出生前對(duì)人胎肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受,出生后移植人胎肝細(xì)胞的方法,建立人鼠嵌合肝動(dòng)物模型.而后接種乙型肝炎病毒(HBV)感染人血清,觀察嵌合在具有正常免疫活性大鼠肝內(nèi)的人肝細(xì)胞是否能感染HBV.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:一、人鼠嵌合肝動(dòng)物模型的初步建

3、立.妊娠14~18日Wistar大白鼠.在無菌操作下,暴露孕鼠子宮,對(duì)胎鼠腹腔內(nèi)注射人胎肝細(xì)胞.逐層縫合,讓孕鼠自然生產(chǎn).胎鼠出生后24小時(shí)內(nèi)于新生小鼠脾內(nèi)注射人胎肝細(xì)胞.采用免疫印跡法(Western blot)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)及免疫組織化學(xué)等方法,于不同時(shí)相檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血清人白蛋白、肝組織中人白蛋白mRNA及人肝細(xì)胞型細(xì)胞角蛋白CK18.結(jié)果于4、6、8周齡大鼠血清中

4、測(cè)出人白蛋白;4、6、8、10周齡大鼠肝組織中測(cè)出人白蛋白mRNA;4、6、8、10、12周齡大鼠肝組織中有CK18表達(dá).上述結(jié)果表明經(jīng)過胚胎期人胎肝細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)其產(chǎn)生免疫耐受的胎鼠,出生后24小時(shí)內(nèi)接受人胎肝細(xì)胞移植,不需要免疫抑制劑而能夠在大鼠肝中存活.移植了人胎肝細(xì)胞的嵌合鼠能表達(dá)人白蛋白,說明移植的人胎肝細(xì)胞不僅在嵌合鼠肝內(nèi)存活,而且能夠保持一定的功能,維持近12周.二、人鼠嵌合肝感染HBV的探索.胚胎期人胎肝細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)其產(chǎn)生免疫

5、耐受的胎鼠,出生后24小時(shí)內(nèi)接受人胎肝細(xì)胞移植,1周齡時(shí)于大鼠腹腔內(nèi)注射肝功能正常的慢性HBV攜帶者血清.血清病毒學(xué)標(biāo)志為HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及核心抗體(抗-HBc)均陽性,HBV DNA定量為7.154E+07.采用自動(dòng)生化分析儀、血清酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、PCR及肝組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染

6、色、免疫組織化學(xué)等方法,于不同時(shí)相檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBsAg、HBV DNA,以及肝組織病理變化和HBsAg.結(jié)果大鼠血清HBsAg陽性率于4、6、8、10、12周齡時(shí)分別為61.9﹪、52.3﹪、38.1﹪、30.9﹪、16.7﹪.接種HBV后4~12周齡所有實(shí)驗(yàn)大鼠ALT均出現(xiàn)了不同程度的增高,其中感染HBV者(稱感染組)ALT值不同時(shí)相點(diǎn)明顯高于未感染者(稱未感染組),整體趨勢(shì)為隨著感染時(shí)間推移呈先升高

7、后逐漸下降的過程,在8周齡時(shí)出現(xiàn)峰值.血清HBV DNA只在HBV感染組4、6、8、10周齡大鼠中檢出,其檢出率分別為69.2﹪、59.1﹪、68.8﹪、46.2﹪.病理觀察顯示,接種HBV后4~12周齡感染組和未感染組均有部分實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織出現(xiàn)細(xì)胞濁腫、變性,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤,但HBV感染組病理改變的檢出率在各時(shí)相點(diǎn)明顯高于未感染組.肝組織HBsAg陽性細(xì)胞只在HBV感染組4、6、8、10周齡大鼠中發(fā)現(xiàn).統(tǒng)計(jì)分析顯示肝組織病理改變檢

8、出率與ALT均值、血清HBV DNA及肝組織HBsAg檢出率之間具有相關(guān)性.結(jié)論:1.采用誘導(dǎo)胎鼠出生前對(duì)人胎肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受,出生后移植人胎肝細(xì)胞的方法,使移植到具有正常免疫活性大鼠體內(nèi)的人胎肝細(xì)胞,不需免疫抑制劑而能夠存活,并且保持人肝細(xì)胞的特性,產(chǎn)生人白蛋白,維持近12周.初步建立人鼠嵌合肝動(dòng)物模型.2.給出生1周的移植了人胎肝細(xì)胞的大鼠接種HBV感染人血清,于4~12周齡可從血清中檢出HBsAg和HBV DNA,且肝組織有HB