水通道蛋白4在局部腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、腦卒中(stroke)作為當(dāng)今世界人口的第二大致死性疾病，因其致殘、復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重危害著人類健康。其中，急性缺血性卒中(acuteiscaemic stroke，AIS)約占腦卒中人群的80％，是由腦局部血供中斷引起的神經(jīng)功能損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，腦血管閉塞可致病變部位缺血缺氧，引起一系列復(fù)雜的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)。盡管目前臨床治療措施很多，但多數(shù)療效并不理想。究其原因，主要由于治療靶點(diǎn)過于單一、無法切斷AIS誘導(dǎo)的信號級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)所致，因此無法避

2、免病程的進(jìn)一步發(fā)生、發(fā)展。 近年來隨著認(rèn)識的不斷深入，愈來愈多的研究發(fā)現(xiàn)，任何致神經(jīng)元損傷的因素均可能同時(shí)波及到腦內(nèi)其他細(xì)胞，尤其是膠質(zhì)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，其病理改變可進(jìn)一步加速神經(jīng)元走向死亡。腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間形成復(fù)雜的信號交談網(wǎng)絡(luò)，在諸多病理生理過程中發(fā)揮特殊作用。因此作為整體功能單位，腦的神經(jīng)功能恢復(fù)不能僅限于單一神經(jīng)元保護(hù)，而應(yīng)著眼于包括膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的整個(gè)“神經(jīng)血管單元(neurovascular unit)”功能

3、的維護(hù)。 神經(jīng)血管單元中，星形膠質(zhì)細(xì)胞由于與神經(jīng)元聯(lián)系緊密，可將血管性信號傳遞至腦內(nèi)，因此被認(rèn)為在腦卒中的病理生理過程中發(fā)揮了決定性作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放膠質(zhì)遞質(zhì)(gliotransmitters)，參與腦內(nèi)多種信息的加工處理，不但對神經(jīng)元突觸信號的傳遞產(chǎn)生影響，還可通過釋放血管活性分子實(shí)現(xiàn)血管緊張度的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。因此，靶向于神經(jīng)血管單元中的膠質(zhì)細(xì)胞、尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)控，已成為腦卒中等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的重要策

4、略。 水通道蛋白4(aquapon-4，AQP4)作為腦內(nèi)含量最豐富、轉(zhuǎn)運(yùn)效率最高的水通道蛋白(aquaporins，AQPs)亞型，主要定位于神經(jīng)血管單元中的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及室管膜上皮細(xì)胞，尤其富集于星形膠質(zhì)細(xì)胞朝向血管面及軟腦膜面的胞膜區(qū)。此分布特點(diǎn)提示，AQP4在腦內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及星形膠質(zhì)細(xì)胞功能維持中發(fā)揮重要作用，可能是膠質(zhì)細(xì)胞參與整個(gè)腦功能調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。大量研究結(jié)果顯示，AOP4基因缺失可致星形膠質(zhì)細(xì)胞多種重要生理

5、功能異常，繼而影響多種病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，AQP4蛋白下調(diào)或缺失可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育、增殖、遷移、修復(fù)等多項(xiàng)功能發(fā)生障礙，空間鉀緩沖能力下降，細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)異常。此外，AQP4還參與了小膠質(zhì)細(xì)胞活化、血一腦屏障(blood-brain barrier，BBB)完整性調(diào)控等過程。已有資料表明，AQP4與腦水腫、腦損傷以及腦腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，腦缺血過程中AQP4的作用僅限于介導(dǎo)腦內(nèi)跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)過程，調(diào)節(jié)腦組織水腫程度。然而

6、AQP4是否還通過影響神經(jīng)血管單元功能、尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，參與腦卒中病程的發(fā)生、發(fā)展，目前尚未見報(bào)道。 本文工作應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室自行制備的AQP4基因敲除鼠，首先發(fā)現(xiàn)AQP4參與局部腦缺血再灌注損傷，從整體、細(xì)胞及分子水平研究并闡明AQP4在腦卒中發(fā)生、發(fā)展中的重要地位，揭示AQP4可通過調(diào)制星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，尤其是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate transporters，GluTs)功能，參與腦卒中病理生理改變的作用機(jī)制。

7、研究結(jié)果不僅為AQP4神經(jīng)生物學(xué)的研究開拓新領(lǐng)域，深化對AQP4生理及病理功能的認(rèn)識，而且揭示AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)，為腦卒中臨床治療學(xué)的突破和研發(fā)理想的神經(jīng)保護(hù)劑提供有益靶標(biāo)第一部分AQP4基因缺失對tMCAO模型小鼠局部腦缺血再灌注損傷的影響目的：研究并闡明AQP4在局部腦缺血再灌注損傷中的作用，探討氟西汀(nuoxetine，F(xiàn)lu)腦缺血保護(hù)與AQP4的相關(guān)性。 方法：應(yīng)用3月齡成年野生型(wildty

8、pe，AQP4+/+)及AQP4基因缺失(AQP4 knockout，AQp44-/-)型雄性CD1小鼠，線栓法建立短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞(transient middle cerebral artery OCClusion，tMCAO)模型，統(tǒng)計(jì)死亡率并行神經(jīng)功能缺陷評分；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3，5-triplaenyltetraz01iumchloride，TTC)染色觀察腦梗死體積變化；免疫組織化學(xué)法觀察神經(jīng)元、星形膠

9、質(zhì)、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)學(xué)改變；干濕比重法檢測腦含水量；Western blotting及免疫組織化學(xué)法測定AQP4表達(dá)。 結(jié)果：AQP4基因缺失后，1)tMCAO模型小鼠死亡率增高，神經(jīng)功能缺陷加重，腦梗死體積增大；缺血再灌注(ischemiareperfhsion，IR)損傷程度與缺血時(shí)間長短的相關(guān)效應(yīng)消失；2)IR所致的海馬CAl區(qū)神經(jīng)元丟失嚴(yán)重，星形及小肢質(zhì)細(xì)胞增殖活化障礙；3)tMCAO術(shù)后24h AQP4蛋白表達(dá)降低

10、，72h表達(dá)增高；4)AQP4基因缺失后小鼠基礎(chǔ)及病理?xiàng)l件下腦含水量均顯著增高。腹腔注射Flu 40 mg/kg,5)顯著降低AQP4+/+型小鼠術(shù)后24 h死亡率、改善小鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙并減小小鼠腦梗死體積，對AQP4-/-型小鼠無上述保護(hù)作用；6)顯著提高AQP4+/+型小鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元存活率，緩解缺血核心區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖(不影響半暗帶星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，對AQP4-/-型小鼠無顯著影響；7)顯著上調(diào)術(shù)后

11、24 h AQP4表達(dá)，下調(diào)術(shù)后72 h AQP4表達(dá)；8)顯著降低AQP4+/+型小鼠術(shù)后72 h腦含水量，對AQP4-/-型小鼠腦含水量無顯著影響。 結(jié)論：AQP4基因缺失導(dǎo)致CDl小鼠局部腦缺血再灌注損傷加重，F(xiàn)lu神經(jīng)保護(hù)作用與調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)相關(guān)。 第二部分AQP4基因缺失對谷氨酸所致興奮性神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制研究。 一、AQP4基因缺失對神經(jīng)元.星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性的影響

12、 目的：研究并闡明AQP4在谷氨酸(glutamate，Glu)引起的興奮性神經(jīng)毒性中的作用，探討其與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)控的相關(guān)性。 方法：取孕13～15 d及生后3 d內(nèi)AQP4+/+及AQp4-/-型CDl小鼠，分別培養(yǎng)原代神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，倒扣爬片法建立神經(jīng)元一星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，Glu 100μM制備興奮性神經(jīng)毒性模型，免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察細(xì)胞形態(tài)改變；LDH王釋放量測定評價(jià)細(xì)胞損傷情況；MTT比色法檢測細(xì)胞活

13、力。 結(jié)果：1)AQP4+/+、AQp4-/-型原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及細(xì)胞生長特性方面未見明顯差異；2)100μM Glu可顯著引起兩種基因型神經(jīng)元.星形膠質(zhì)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞總LDH釋放增加，AQP4-/-型釋放量顯著高于AQP4+/+型；3)AQP4基因缺失后Glu所致星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH王釋放減少、存活率增加，提示共培養(yǎng)體系中增高的LDH主要由受損神經(jīng)元釋放。 結(jié)論：星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)元-星形膠質(zhì)

14、細(xì)胞共培養(yǎng)體系Glu誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性損傷加重、星形膠質(zhì)細(xì)胞自身對Glu毒性的敏感度降低，表明AQP4參與Glu興奮性神經(jīng)毒性損傷過程，揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞功能改變可能是加劇共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因素。 二、AQP4基因缺失加重谷氨酸所致興奮性神經(jīng)毒性損傷機(jī)制的研究 目的：研究并闡明AQP4基因缺失導(dǎo)致Glu興奮性神經(jīng)毒性損傷加重的具體機(jī)制，探討其與星形膠質(zhì)細(xì)胞GluTs功能調(diào)控的相關(guān)性。 方法：取生后3 d

15、內(nèi)AQP4+/+及AQP4-/-型CDl乳鼠，原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR及Westem blotting測定細(xì)胞GluTsmRNA及蛋白表達(dá)；[3H]-D，L-G1u同位素標(biāo)記法檢測細(xì)胞Glu攝取功能。 結(jié)果：AOP4基因缺失后，1)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter 1，GLT-1)mRNA及蛋白水平下調(diào)，谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/aspartate transpo

16、rter, GLAST)水平無顯著改變；2)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取[3H]-D,L-Glu能力降低。 結(jié)論：AQP4基因缺失下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)，降低細(xì)胞Glu攝取能力，表明AQP4參與星形膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)控，其缺失導(dǎo)致Glu興奮性神經(jīng)毒性損傷加重的機(jī)制可能與GluTs功能降低有關(guān)。 綜上所述，本研究工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于： 1.應(yīng)用AQP4基因缺失小鼠，從整體、細(xì)胞和分子水平系統(tǒng)研究并闡明AOP4與腦卒中的發(fā)

17、生、發(fā)展相關(guān)，明確其機(jī)制在于對星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究結(jié)果豐富并拓展了AQP4在腦卒中神經(jīng)損傷中的作用機(jī)制，為疾病的臨床治療提供了新的思路。 2.揭示Flu的腦缺血保護(hù)作用與調(diào)節(jié)AQP4表達(dá)相關(guān)，為將AQP4調(diào)節(jié)劑發(fā)展成為腦卒中治療的新型藥物積累了必要的學(xué)術(shù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 3.首次發(fā)現(xiàn)AQP4參與調(diào)控Glu興奮性神經(jīng)毒性過程，闡明其機(jī)制在于調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞GluTs表達(dá)及Glu攝取功能，揭示AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)