水通道蛋白1、3在大鼠肺組織缺血再灌注損傷后的表達及意義.pdf

1、目的:
　　 1.以大鼠肺組織為研究對象,建立一種簡單、可靠、重復性好的腫移植動物實驗模型,模擬肺移植過程中肺組織熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷過程。
　　 2.應用免疫組化和分子生物學技術,研究肺組織熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷過程中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白3(AQP3)的表達及其功能,以及藥物對其影響；探討其表達與肺移植后肺損傷的關系,進一步闡明肺移植過程中肺熱缺血損傷以及缺血再灌注損傷的發(fā)生機制；為今后臨

2、床調控水通道治療肺移植后肺損傷提供科學的理論與實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.大鼠肺組織缺血再灌注損傷動物模型的建立以及肺組織水通道蛋白的檢測。
　　 將40只大鼠隨機分為供體組和受體組,每組20只。供體組再隨機分為2組,每組10只,分別為LPD灌注組與LPD+金納多組；受體組也隨機分為2組,每組10只。獲取供體組大鼠左肺為實驗組,應用受體組大鼠建立離體肺缺血再灌注模型。A組即LPD灌注組,供體大鼠左肺經(jīng)肺動

3、脈灌注LPD液后于4℃保存8小時,然后將受體鼠靜脈血經(jīng)左側股靜脈插管引出并灌注供體肺,供肺氧合后的動脈血經(jīng)左側股動脈回輸受體鼠.循環(huán)灌注1小時,供體右肺為對照組,即B組；C組即LPD+金納多組,供體肺缺血前15分鐘經(jīng)靜脈給予金納多20mg/kg,余處理同LPD組,供體右肺為對照組,設為D組。造模成功后,取A、B、C、D四組肺組織；應用免疫組化法、免疫印跡法、RT-PCR法檢測肺組織AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表達。
　　

4、2.大鼠肺組織熱缺血損傷動物模型的建立以及肺組織水通道蛋白的檢測。
　　 將30只SD大鼠隨機分為A組:熱缺血時間0小時(n=10); B組:熱缺血時間1小時(n=10)；C組:熱缺血時間2小時(n=10).。大鼠用1％戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg),無需氣管插管。沿前正中線剪開胸骨及腹壁,離斷腹主動脈放血至心跳停跳。處死后,A組:取左肺,立即用LPD液灌注；B組:室溫下放置60min,不進行任何處理,再灌注肺保護液；C組:室

5、溫下放置120min,不進行任何出理,再灌注肺保護液。造模成功后,切取部分肺組織,免疫組化法、免疫印跡法、RT-PCR法檢測肺組織AQP1,AQP3蛋白和mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1.建立離體大鼠肺組織缺血再灌注損傷動物模型,進行模擬肺移植后,灌注流量穩(wěn)定可調,移植肺氣體交換好,能夠模擬肺移植的循環(huán)過程。
　　 2.離體肺缺血再灌注損傷后肺組織水通道蛋白的檢測:
　　 AQP1表達在肺組織血管

6、內皮細胞,AQP3表達在細支氣管上皮細胞、肺泡Ⅱ型細胞和粘膜下腺分泌細胞。AQP1在A組,以及B組肺組織中的mRNA表達平均相對A值分別為0.30±0.08、0.63±0.10,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),AQP3分別為0.49±0.09、0.85±0.06,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AQP1在C組,以及D組肺組織中的mRNA表達平均相對A值分別為0.49±0.11、0.68±0.12,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),A

7、QP3分別為0.73±0.12、0.91±0.13,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05):比較AQP1和AQP3在A組與C組肺組織中的mRNA表達平均相對A值差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 在A組以及B組肺組織中AQP1蛋白表達的相對灰度值分別為0.65±0.06、1.13±0.18,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AQP3蛋白分別為0.52±0.11、1.92±0.26,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在C組以及D

8、組肺組織中AQP1蛋白表達的相對灰度值分別為0.88±0.11、1.25±0.21,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),AQP3分別為0.96±0.18、1.89±0.32,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；比較AQP1和AQP3在A組與C組肺組織中蛋白表達的相對灰度值,差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.肺熱缺血損傷后肺組織水通道蛋白的檢測:
　　 AQP1在熱缺血時間0小時,1小時和2小時組的肺組織中的mR

9、NA表達平均相對A值分別為0.63±0.10、0.49±0.07、0.36±0.06,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),AQP3分別為0.85±0.06、0.76±0.08、0.52±0.07,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。蛋白印跡分析結果顯示:B組C組肺組織AQP1和AQP3蛋白含量顯著下降,在熱缺血時間0小時,1小時和2小時組的肺組織中AQP1蛋白表達的相對灰度值分別為1.13±0.18、0.88±0.13、0.76±0.09,

10、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AQP3蛋白分別為1.92±0.26、0.95±0.15、0.61±0.07,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.離體大鼠肺組織缺血再灌注損傷動物模型以及肺組織熱缺血損傷動物模型具有操作簡單、可靠、經(jīng)濟的特點,為研究肺移植過程中不同階段肺損傷的機制提供了良好的平臺。
　　 2.大鼠肺組織有AQP1及AQP3的表達。AQP1主要表達在肺組織血管內皮細胞,AQ

11、P3表達在細支氣管上皮細胞、肺泡Ⅱ型細胞和粘膜下腺分泌細胞。
　　 3.大鼠肺組織缺血再灌注損傷后,AQP1,AQP3表達下調,提示缺血再灌注損傷可能與AQP1,AQP3表達下調有關；缺血前應用金納多可使AQP1,AQP3表達下調程度減弱。提示金納多可能通過調控水通道表達水平減輕肺移植后缺血再灌注損傷。
　　 4.熱缺血損傷過程中,AQP1,AQP3表達明顯下調,且熱缺血損傷時間不同,AQP1,AQP3表達下調程度有顯著