自噬在脂肪細(xì)胞慢性炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用及雷帕霉素的抗炎機制研究.pdf

1、第一部分脂肪細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)自噬的作用及機制研究
　　目的:探討高脂環(huán)境下自噬活性的變化及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。
　　方法:通過Western blot、免疫熒光、電鏡三種方法檢測棕櫚酸負(fù)荷下分化成熟脂肪細(xì)胞自噬活性的變化;RT-PCR和Western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路，觀察自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的先后順序，并通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路觀察自噬水平的變化，明確自噬的誘導(dǎo)機制;通過藥物性抑制自噬，分別用Wester

2、n blot方法檢測對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號及MTT法檢測對細(xì)胞存活率的影響。
　　結(jié)果:棕櫚酸顯著誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞自噬活性的增加，表現(xiàn)為自噬體和自噬溶酶體形成增多，自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ的積累量增多及自噬流的增加;棕櫚酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生且先于自噬的激活，并且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致LC3-Ⅱ的積累量降低;此外，抑制自噬增加了細(xì)胞對應(yīng)激和凋亡的敏感性。
　　結(jié)論:棕櫚酸激活成熟分化脂肪細(xì)胞的自噬活性增加;自噬的激活部分依賴

3、棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑;自噬作為適應(yīng)性反應(yīng)在應(yīng)激環(huán)境下增加細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞調(diào)亡的抵抗。
　　第二部分自噬對脂肪細(xì)胞的炎癥因子的調(diào)節(jié)作用
　　目的:探討自噬激活對脂肪細(xì)胞炎癥因子的調(diào)節(jié)作用
　　方法:通過免疫組化和RT-PCR方法，觀察飲食誘導(dǎo)肥胖鼠脂肪組織及高脂誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的炎癥表現(xiàn)以及自噬相關(guān)基因的表達(dá)，明確炎癥和自噬的水平;分別通過藥物性抑制和siRNA干擾自噬基因的方法阻斷自噬，RT-PCR方法檢測炎癥

4、因子MCP-1和IL-6的表達(dá)水平，明確自噬對炎癥因子的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:飲食誘導(dǎo)肥胖鼠脂肪組織切片的H&E染色和CD68免疫組化分析結(jié)果表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的浸潤增加，RT-PCR方法檢測棕櫚酸誘導(dǎo)分化脂肪細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)水平上調(diào)。肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織及棕櫚酸誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞都表現(xiàn)為自噬基因的表達(dá)升高。3-MA自噬特異性抑制和siRNA轉(zhuǎn)染自噬相關(guān)基因Becn1干擾自噬的形成，RT-PCR法檢測MCP-1和IL-6的表達(dá)水平上調(diào)。

5、r>　　結(jié)論:在肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織和單獨脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中自噬被激活，自噬作為應(yīng)激環(huán)境下的適應(yīng)性機制參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并發(fā)揮抗炎的作用。
　　第三部分雷帕霉素的抗應(yīng)激和抗炎作用及其與自噬活性的關(guān)系
　　目的:探討雷帕霉素的抗應(yīng)激和抗炎作用及其與自噬活性的關(guān)系
　　方法:Western blot方法檢測mTORC1信號下游磷酸化S6K1蛋白表達(dá)，觀察棕櫚酸對mTORC1信號的影響，同時驗證雷帕霉素對脂肪細(xì)胞mTORC

6、1信號的抑制作用。分別用雷帕霉素預(yù)處理脂肪細(xì)胞，通過Westem blot和RT-PCR方法檢測雷帕霉素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號蛋白和炎癥因子及炎癥通路NF-κB表達(dá)的影響;并通過藥物性抑制和siRNA干擾自噬的方法進一步明確，雷帕霉素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用與自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果:棕櫚酸顯著誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞磷酸化S6K1蛋白表達(dá)增加，且可被雷帕霉素所抑制;雷帕霉素顯著下調(diào)棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號蛋白的表達(dá)，但CQ抑制自噬消除了雷帕霉