雷帕霉素調(diào)控髓系來源抑制性細(xì)胞(MDSCs)在急性移植物抗宿主病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究中首先建立了穩(wěn)定的小鼠異基因骨髓移植模型，分析了移植后小鼠aGVHD模型中外周血及脾臟中MDSCs的數(shù)量及功能的變化規(guī)律及其與aGVHD的關(guān)系;接著研究了RAPA治療對aGVHD模型中MDSCs及其各亞群的數(shù)量及功能的影響;最后對RAPA在體外對MDSCs不同亞群的調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了深入的探討。我們的研究對于揭示MDSCs免疫抑制功能調(diào)控的新機(jī)制，尋找aGVHD有效預(yù)防和治療的新策略具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　第

2、一章 小鼠急性移植物抗宿主病模型中MDSCs數(shù)量及功能的變化研究
　　目的：通過建立小鼠異基因骨髓移植模型，檢測移植后小鼠aGVHD模型中外周血及脾臟中MDSCs及其亞群的數(shù)量及功能的變化規(guī)律，分析其與aGVHD的關(guān)系，為探討MDSCs細(xì)胞在allo-HSCT中對aGVHD的調(diào)節(jié)作用提供線索。
　　方法：建立小鼠異基因骨髓移植模型，通過觀察生存、體重、脫毛等癥狀，檢測供者細(xì)胞嵌合度，各臟器病理HE染色及CD3免疫組化等方法來

3、鑒定造模是否成功;建立不同嚴(yán)重程度的aGVHD模型，利用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）各組模型小鼠外周血及脾臟MDSCs及其各亞群的比例變化;分選移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）各組模型小鼠骨髓MDSCs，與活化的小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)3.5天，CFSE法檢測小鼠脾細(xì)胞增殖率，計(jì)算增殖抑制率;分選移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）各組模型小鼠骨髓MDSCs，與活化的小鼠脾臟

4、CD4+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)5天，F(xiàn)CM檢測CD4+CD25+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，以評估MDSCs體外誘導(dǎo)Treg生成能力。
　　結(jié)果：通過X射線8Gy輻照清髓，單純回輸去T骨髓細(xì)胞(T-cell-depleted bonemarrow cells，BM-TCD)建立無aGVHD模型，回輸BM-TCD+T建立aGVHD模型，根據(jù)回輸?shù)腡細(xì)胞量控制aGVHD的輕重程度。移植后7天流式檢測嵌合度提示完全嵌合狀態(tài)，aGVHD組可在移

5、植后16天左右逐步出現(xiàn)體重下降、弓背、腹瀉、脫毛、活動減少等aGVHD癥狀，移植后21天檢測各臟器病理，aGVHD組可見細(xì)胞壞死，結(jié)構(gòu)破壞，有大量CD3淋巴細(xì)胞浸潤。流式檢測移植后各組模型中MDSCs及其各亞群比例，移植后2周各組小鼠外周血及脾臟中的MDSCs及各亞群的比例均處于較高水平，而移植后4周時，無aGVHD組的外周血及脾臟MDSCs及其各亞群水平有顯著下降，而輕度及中重度aGVHD組的MDSCs比例仍保持在較高水平，其中脾臟M

6、DSCs比例與aGVHD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，中重度組的比例較輕度組更高。淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果提示發(fā)生aGVHD后體內(nèi)MDSCs的抑制脾細(xì)胞增殖的功能減弱。體外誘導(dǎo)Treg生成實(shí)驗(yàn)提示發(fā)生aGVHD后體內(nèi)MDSCs的體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的功能受損。
　　結(jié)論：小鼠異基因骨髓移植后aGVHD可誘導(dǎo)脾臟MDSCs的聚集，且與aGVHD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，但aGVHD小鼠模型中MDSCs的淋巴細(xì)胞增殖抑制功能及誘導(dǎo)Treg生成功能受損。

7、
　　第二章 雷帕霉素對小鼠急性移植物抗宿主病模型中MDSCs的作用及機(jī)制研究
　　目的：在第一章建立小鼠異基因骨髓移植及aGVHD模型的基礎(chǔ)上，用RAPA治療小鼠aGVHD，對治療后aGVHD模型體內(nèi)MDSCs及其各亞群的數(shù)量及功能的影響進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。
　　方法：建立小鼠異基因骨髓移植及aGVHD模型，予RAPA腹腔注射治療，觀察aGVHD癥狀、體重變化曲線，送檢各臟器CD3免疫組化觀察T細(xì)胞浸

8、潤情況;利用FCM術(shù)檢測移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）模型小鼠外周血及脾臟MDSCs及其各亞群的比例變化;流式分選移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）各組模型小鼠骨髓G-MDSCs亞群，與活化的小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)3.5天，CFSE法檢測小鼠脾細(xì)胞增殖率，計(jì)算增殖抑制率;用qPCR的方法檢測移植后4周模型小鼠骨髓G-MDSCs細(xì)胞中免疫抑制因子的表達(dá)情況;在G-MDSCs與脾細(xì)胞共培養(yǎng)體系中分別加入iNOS抑制劑L-NMNA、Ar

9、g1抑制劑nor-NOHA、L-NMNA+nor-NOHA，觀察脾細(xì)胞增殖抑制率的變化。分選移植后不同時間點(diǎn)（移植后2周、4周）模型小鼠骨髓G-MDSCs，與活化的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)5天，F(xiàn)CM術(shù)檢測CD4+CD25+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，以評估G-MDSCs體外誘導(dǎo)Treg生成能力。
　　結(jié)果：RAPA治療可顯著減輕模型小鼠aGVHD癥狀，明顯減少各臟器中CD3淋巴細(xì)胞的浸潤。流式檢測移植后模型MDSCs及其

10、各亞群比例，移植后2周時各組小鼠外周血及脾臟中的MDSCs及各亞群的比例均處于較高水平，移植后4周時，無aGVHD組的外周血及脾臟MDSCs有明顯的下降，而RAPA治療組脾臟MDSCs及G-MDSCs亞群比例較其他組有顯著上升。淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果提示發(fā)生aGVHD后體內(nèi)MDSCs的抑制淋巴細(xì)胞增殖的功能減弱，但移植后4周時RAPA治療組G-MDSCs免疫抑制功能可升高至無aGVHD組水平。qPCR方法檢測免疫抑制因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RAP

11、A治療組G-MDSCs細(xì)胞中iNOS及Arg1的表達(dá)水平較其他組顯著升高，在共培養(yǎng)體系中加入兩種因子的抑制劑L-NMNA及nor-NOHA后，淋巴細(xì)胞的增殖水平明顯提高，即可減弱G-MDSCs的免疫抑制功能。體外誘導(dǎo)Treg生成實(shí)驗(yàn)提示發(fā)生aGVHD后MDSCs的體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的功能受損，但移植后4周時RAPA治療組G-MDSCs體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的功能可恢復(fù)。
　　結(jié)論：我們首次發(fā)現(xiàn)RAPA可通過調(diào)控MDSCs來

12、發(fā)揮aGVHD的防治作用，RAPA治療可誘導(dǎo)aGVHD小鼠脾臟MDSCs，特別是G-MDSCs亞群的聚集;RAPA治療可提高aGVHD體內(nèi)G-MDSCs的免疫抑制功能，其作用主要通過提高G-MDSCs細(xì)胞中iNOS及Arg1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。此外，RAPA還可提高aGVHD模型G-MDSCs體外誘導(dǎo)Treg生成的能力。
　　第三章 雷帕霉素對MDSCs及其各亞群的體外調(diào)控及機(jī)制研究
　　目的：明確RAPA在體外對MDSCs不同亞群

13、的免疫調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：用不同濃度的RAPA體外預(yù)處理B6小鼠骨髓CD11b+Gr1+，后與脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)，CFSE法檢測小鼠脾細(xì)胞增殖率，計(jì)算增殖抑制率;流式檢測RAPA預(yù)處理前后骨髓CD11b+Gr1+細(xì)胞分別對CD4+T和CD8+T的抑制作用;流式分選小鼠骨髓MDSCs不同亞群，RAPA預(yù)處理后與脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)，檢測RAPA預(yù)處理對不同亞群MDSCs免疫抑制功能的影響;建立小鼠aGVHD模型，予經(jīng)RAPA

14、預(yù)處理的G-MDSCs過繼回輸治療，觀察模型小鼠的生存改善情況;檢測RAPA預(yù)處理前后G-MDSCs與小鼠脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中T細(xì)胞的凋亡情況及CD4+T細(xì)胞向Th1/Th2細(xì)胞的分化情況;用CBA法檢測共培養(yǎng)上清中Th1/Th2細(xì)胞因子的濃度;RAPA預(yù)處理小鼠骨髓G-MDSCs，與活化的小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)5天，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，探討RAPA預(yù)處理對G-MDSCs體外誘導(dǎo)Tre

15、g生成能力的影響。用qPCR法檢測RAPA預(yù)處理對G-MDSCs細(xì)胞中免疫抑制因子的表達(dá)情況的影響。分別用比色法、ELISA法、CM-H2DCFDA法檢測共培養(yǎng)上清Arg1、PGE2濃度及胞內(nèi)ROS水平。
　　結(jié)果：使用不同濃度的RAPA預(yù)處理小鼠骨髓CD11b+Gr1+，發(fā)現(xiàn)RAPA100nM預(yù)處理濃度可顯著增強(qiáng)CD11b+Gr1+的淋巴細(xì)胞增殖抑制功能，對CD4+T及CD8+T細(xì)胞的抑制功能均有顯著的增加。分析RAPA對MDS

16、Cs不同亞群免疫抑制功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)在初始狀態(tài)下G-MDSCs亞群并不具有免疫抑制性，而M-MDSCs亞群本身就具有非常強(qiáng)的免疫抑制功能，但當(dāng)兩者經(jīng)過RAPA預(yù)處理之后，G-MDSCs細(xì)胞被誘導(dǎo)出了明顯的免疫抑制性，而M-MDSCs細(xì)胞的免疫抑制功能則有所減弱。給予小鼠aGVHD模型回輸G-MDSCs及RAPA-pretreated G-MDSCs，發(fā)現(xiàn)兩者對aGVHD均具有保護(hù)作用，而RAPA-pretreated G-MDSCs

17、的免疫保護(hù)作用更強(qiáng)。RAPA誘導(dǎo)G-MDSCs免疫抑制功能并非通過誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，但可顯著減少CD4+T細(xì)胞向Th1/Th2細(xì)胞的分化，并可增強(qiáng)G-MDSCs體外誘導(dǎo)Treg生成的能力。qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)RAPA預(yù)處理的G-MDSCs中Arg1及iNOS表達(dá)水平較未處理組下降，而COX2、IL-10、TGF-β及NOX2表達(dá)無顯著差別。收集共培養(yǎng)上清，檢測Arg1濃度及胞內(nèi)ROS水平，兩組無顯著差異。ELISA法檢測共培養(yǎng)上清中PGE