自噬在阿霉素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、研究背景:鹽酸阿霉素是臨床上最常用的一種葸環(huán)類抗瘤藥物，它具有較廣的抗腫瘤譜。但是，長(zhǎng)期使用阿霉素可引起嚴(yán)重的心肌細(xì)胞損傷最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡，臨床上表現(xiàn)為不可逆轉(zhuǎn)的心肌病和充血性心力衰竭。從而限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。目前阿霉素的心臟毒性機(jī)制尚未完全闡明，之前的研究認(rèn)為阿霉素可在體內(nèi)形成大量自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化，并引起心肌細(xì)胞能量代謝的紊亂，最終導(dǎo)致心臟功能受損。近幾年來(lái)，自噬在心血管疾病中的作用受到了廣泛的關(guān)注，自噬是一種將細(xì)胞內(nèi)受

2、損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及損壞的細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)進(jìn)行消化降解并清除的過(guò)程，在不同的心肌病理學(xué)中，自噬的變化可能是心肌細(xì)胞的代償性反應(yīng)，也可能導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。本課題旨在研究阿霉素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷過(guò)程中，自噬是否參與這一過(guò)程，并且研究其作用機(jī)制。
　　 研究目的:旨在研究阿霉素誘導(dǎo)小鼠心肌損傷模型中，自噬的作用及其作用機(jī)制，明確自噬在阿霉素心肌病中的作用，為阿霉素心肌病的治療提供新的策略。
　　 研究方法:雄性C57

3、小鼠，年齡在10-12周左右，體重在24-28g之間，隨機(jī)的分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠采用鹽酸阿霉素25mg/kg/d的劑量給予腹腔注射一次，造成小鼠急性心肌損傷的模型，對(duì)照組給予等劑量的生理鹽水，分別于注射后1d，2d，4d時(shí)取材，取材前18個(gè)小時(shí)注射Evans blu dye(100mg/kg)，取心臟稱重，脛骨測(cè)其長(zhǎng)度計(jì)算心臟重量與脛骨長(zhǎng)度的比值，取心臟標(biāo)本，通過(guò)HE染色觀察心肌組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)的改變，WGA染色觀察心肌細(xì)胞壞死

4、情況，Real time PCR檢測(cè)Nrf2及其下游基因以及自噬相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)。Western blot檢測(cè)Nrf2及其下游基因以及自噬相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)。關(guān)于自噬流的檢測(cè)，我們用雄性C57小鼠，年齡在10-12周左右，體重在24-28g之間，將其隨機(jī)分為生理鹽水+雷帕霉素、生理鹽水+雷帕霉素+氯奎、阿霉素+雷帕霉素、阿霉素+雷帕霉素+氯奎四組，每組n=4.阿霉素以25mg/kg/d的劑量腹腔注射一次，生理鹽水以等體積的

5、量腹腔注射，注射后4天取材，取材前4小時(shí)腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg/d)以及氯奎(10mg/kg/d).取左心室標(biāo)本，通過(guò)western blot檢測(cè)LC3及P62的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射鹽酸阿霉素1天后，小鼠的體重逐漸減輕，與給藥前體重相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01).注射阿霉素2天后小鼠心臟重量與脛骨長(zhǎng)度的比值逐漸減小，與對(duì)照組小鼠相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠注射

6、阿霉素4天后，心肌細(xì)胞中出現(xiàn)大量的空泡結(jié)構(gòu)。WGA染色顯示小鼠注射阿霉素后與對(duì)照組小鼠相比出現(xiàn)大面積的心肌細(xì)胞壞死。Real-time PCR檢測(cè)Nrf2及其下游基因NQO1，HO-1的表達(dá)在注射阿霉素后逐漸升高，自噬相關(guān)基因Beclin1、ATG14L、ATG5、ATG7以及LC3與對(duì)照組相比表達(dá)升高，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Rubicon的表達(dá)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠有下降的趨勢(shì)，二者比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Westen blot分

7、析，注射阿霉素的小鼠體內(nèi)NQO1蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組小鼠，LC3、P62蛋白水平的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，而ATG5、ATG7、LAMP1和Cathepthin D的表達(dá)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。泛素Ub的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組相比有明顯升高的趨勢(shì)。自噬流的檢測(cè)結(jié)果顯示:生理鹽水的對(duì)照組小鼠中，注射雷帕霉素+氯奎后與只注射雷帕霉素組小鼠相比，LC3及P62的表達(dá)明顯升高，二者之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、(p＜0.01)。而阿霉素組，注射雷帕霉素+氯奎后與只注射雷帕霉素組小鼠相比LC3及P62的表達(dá)無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)阿霉素誘導(dǎo)急性心肌損傷過(guò)程中，小鼠體內(nèi)啟動(dòng)了抗氧化應(yīng)激途徑。
　　 (2)阿霉素誘導(dǎo)急性心肌損傷過(guò)程中，誘導(dǎo)了自噬小體形成途徑的激活。
　　 (3)阿霉素誘導(dǎo)急性心肌損傷過(guò)程中，自噬小體的清除受到障礙，自噬流的平衡遭到破壞。
　　 (4)阿