自噬在新生隱球菌誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　隱球菌性腦膜炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，其發(fā)病兇險，治療困難，死亡率高。該病在國外主要發(fā)生在免疫功能低下的患者如HIV感染患者，但在國內(nèi)，新生隱球菌感染的患者多為沒有基礎(chǔ)疾病的或無免疫抑制的人群中。細(xì)胞自噬是普遍存在于真核細(xì)胞中，參與正常細(xì)胞生長發(fā)育和生理病理過程的生命征象。自噬參與機體的很多病理過程，比如殺滅病原菌，調(diào)節(jié)免疫甚至殺滅腫瘤細(xì)胞。自噬在新生隱球菌感染巨噬細(xì)胞時所發(fā)揮的作用及其可能誘發(fā)的免疫應(yīng)答情況目前

2、尚無具體報道。故實驗旨在通過新生隱球菌誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，來觀察自噬在新生隱球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞時發(fā)生的變化，并通過檢測相關(guān)炎性因子TNF-α、IL-6的表達量，來探究自噬在新生隱球菌誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中產(chǎn)生及其可能的作用途經(jīng)，為探討自噬在新生隱球菌所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中所發(fā)揮的作用及可能機制提供一定的參考。
　　方法:
　　第一部分，新生隱球菌最佳干預(yù)濃度檢測及驗證自噬體的表達。體外培養(yǎng)小鼠單

3、核巨噬細(xì)胞系RAW264.7，將滅活的新生隱球菌WM148與RAW264.7細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)1∶1、2∶1、4∶1、8∶1培養(yǎng)，設(shè)立0h、3h、6h、9h、12h時間點，用CCK-8試劑盒檢測RAW264.7細(xì)胞的活性。篩選出最適宜濃度后，將細(xì)胞進行爬片后進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察自噬的存在。
　　第二部分，新生隱球菌誘導(dǎo)自噬的表達規(guī)律，將培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞按照細(xì)胞數(shù)與隱球菌數(shù)1∶4的比例共培養(yǎng)，在0h、1h、3h、

4、5h、7h時間點來收集細(xì)胞，用細(xì)胞流式方法檢測各時間點的細(xì)胞凋亡，然后提取蛋白及RNA，通過Western blot及qRT-PCR方法分別檢測自噬體在各時間點的表達情況。利用自噬體抑制劑（3-MA）抑制自噬后，觀察細(xì)胞前后凋亡趨勢變化。
　　第三部分，自噬的表達及相關(guān)炎癥因子變化情況。體外培養(yǎng)的鼠單核巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞，與新生隱球菌1∶4干預(yù)，將0h、1h、3h、5h、7h時間點上清液和細(xì)胞分別收集到離心管中。采用E

5、LISA方法檢測各組上清液中TNF-α、IL-6隨著時間的變化，表達水平的變化，加入自噬抑制劑3-MA后，再次檢測各時間點TNF-α及IL-6的表達情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分，不同濃度新生隱球菌干預(yù)巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞的凋亡率均有度的升高，并且濃度越高、干預(yù)的時間越長，細(xì)胞凋亡率越高。因此，結(jié)合試驗所需并查閱相關(guān)文獻后，采用細(xì)胞與隱球菌按照1∶4數(shù)量比來干預(yù)。通過免疫熒光顯色方法可直接觀察到自噬的產(chǎn)生。
　　第二

6、部分，新生隱球菌誘導(dǎo)后，細(xì)胞中自噬體的表達對比對照組(0h)明顯升高(P＜0.05），且隨著干預(yù)時間延長，自噬的表達量逐漸升高。1h、3h、5h、7h組較對照組(0h)組逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，自噬抑制后較抑制前，細(xì)胞的增殖減少，表明自噬對維持細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。
　　第三部分，新生隱球菌誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后，各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的表達較對照組0h組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

7、，抑制自噬后，各組細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-6的表達量較0h組增加但較未抑制時降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　新生隱球菌的干預(yù)可以對巨噬細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響，且干預(yù)的濃度與凋亡率呈正相關(guān)。新生隱球菌誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎性反應(yīng)后，自噬體會隨之表達，自噬表達水平隨干預(yù)時間延長而逐漸增加，炎性因子TNF-α、IL-6的分泌也隨著自噬體的增加或抑制而呈現(xiàn)不同的趨勢。表明自噬參與并調(diào)控新生隱球菌誘導(dǎo)R