大鼠退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：大鼠尾椎纖維環(huán)穿刺法建立椎間盤退變模型的研究
　　 研究背景：
　　 下腰痛(Low Back Pain)是現(xiàn)代社會(huì)中極為常見的疾患，80％以上的人一生中曾有過下腰痛的經(jīng)歷，給社會(huì)和家庭均造成了沉重的負(fù)擔(dān)。下腰痛病因復(fù)雜，其中椎間盤退變(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)及其繼發(fā)的一系列疾病，如腰椎間盤突出癥、椎間盤源性疼痛、腰椎管狹窄癥及退變性腰椎滑脫癥等被公認(rèn)為是導(dǎo)致

2、下腰痛的主要原因。我國(guó)人口眾多且社會(huì)老齡化逐年加劇，對(duì)腰腿痛病人的診治、康復(fù)及由此引起的勞動(dòng)力喪失給全社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致了眾多患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重下降；重視椎間盤退變性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年眾多學(xué)者提出了各種以逆轉(zhuǎn)或再生退變椎間盤為目的的生物治療方法，包括基因治療、細(xì)胞移植、生長(zhǎng)因子直接注射等。而無論是評(píng)價(jià)與篩選各種新型生物治療手段的效果，還是深入研究椎間盤退變的病理生理機(jī)制，選擇與構(gòu)建合適的動(dòng)物模型都具

3、有十分重要的意義，是進(jìn)行椎間盤方面研究的基礎(chǔ)。
　　 大鼠等嚙齒類動(dòng)物以其易于獲得、適合多種實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、可耐受手術(shù)創(chuàng)傷、飼養(yǎng)方便且成本較低的優(yōu)點(diǎn)，在眾多研究中得到了廣泛應(yīng)用，是最常用的椎間盤退變動(dòng)物模型之一。既往研究中多采用特殊的機(jī)械持續(xù)加壓裝置改變大鼠脊柱生物力學(xué)環(huán)境的方法來達(dá)到引起椎間盤退變的目的，但操作復(fù)雜，不適合較多數(shù)量的篩查實(shí)驗(yàn)。而直接利用穿刺針損傷纖維環(huán)的辦法具有操作微創(chuàng)、可控性與可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，已在兔、羊、豬等多種

4、動(dòng)物模型中得到廣泛應(yīng)用，但用于大鼠尾椎這一特殊解剖部位的研究尚剛剛起步。
　　 目的：
　　 建立一種操作簡(jiǎn)便、效果可靠的大鼠尾椎椎間盤退變模型，同時(shí)也為下一部分的課題提供退變的尾椎間盤髓核組織。
　　 方法：
　　 定位大鼠尾椎的Co4/5及Co8/9椎間隙，無菌條件下分別做一個(gè)長(zhǎng)度約0.5cm的小切口，切開皮膚、皮下組織直接顯露白色的椎間盤，然后用21 G的注射器針頭平行于終板刺入纖維環(huán)，深度以尖端夾

5、持的血管鉗控制在3mm。刺入后緩慢旋轉(zhuǎn)360度，再停留約30秒鐘后拔出。3-0絲線縫合皮膚。術(shù)后2周應(yīng)用X線、MRI及組織學(xué)(蘇木素-伊紅)染色觀察評(píng)估退變發(fā)生情況。
　　 結(jié)果：
　　 穿刺手術(shù)后2周，與空白對(duì)照及假手術(shù)組椎間盤相比，在X線片上穿刺椎間隙高度指數(shù)并沒有發(fā)生明顯變化(P=0.246)。術(shù)后尾椎MRI顯示，在T2加權(quán)像上，無論是與未手術(shù)的相鄰節(jié)段還是與其它對(duì)照組椎間盤相比，穿刺后的椎間盤信號(hào)強(qiáng)度都明顯降低。

6、各組動(dòng)物的Pfirrmann分級(jí)差異明顯，空白對(duì)照組椎間盤基本均屬完全正常的Ⅰ級(jí)表現(xiàn)，假手術(shù)組有少數(shù)椎間盤稍有退變改變，而穿刺組各個(gè)節(jié)段都發(fā)生了明顯的改變，其中Pfirrmann分級(jí)Ⅲ級(jí)表現(xiàn)最多，有6個(gè)，Ⅱ級(jí)與Ⅳ級(jí)表現(xiàn)各為2個(gè)椎間盤，但沒有出現(xiàn)非常嚴(yán)重退變的Ⅴ級(jí)表現(xiàn)。蘇木素-伊紅染色發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠尾椎椎間盤內(nèi)結(jié)構(gòu)比較完整，髓核與纖維環(huán)分界清楚，橢圓形髓核組織占據(jù)了整個(gè)尾椎間盤面積2/3以上的區(qū)域，排列較緊密的髓核細(xì)胞分布較均

7、勻；纖維環(huán)結(jié)構(gòu)齊整、排列規(guī)則，各層纖維軟骨板呈同心圓狀分布，無裂痕，成纖維細(xì)胞間斷分布其間。而在穿刺后2周的椎間盤呈較為明顯的退變性改變，即髓核組織面積逐漸縮小，約占整個(gè)椎間盤區(qū)域的一半以下，與纖維環(huán)之間的連續(xù)性中斷、空隙增寬；髓核細(xì)胞盡管仍是軟骨細(xì)胞樣外觀，但數(shù)目減少，出現(xiàn)明顯的空泡樣變性，著色稍淡，細(xì)胞外基質(zhì)分散，部分髓核被纖維樣物質(zhì)所取代。纖維環(huán)失去了規(guī)整的同心圓結(jié)構(gòu)，排列紊亂，出現(xiàn)明顯的向心性裂隙，顏色稍淡染，纖維環(huán)中成纖維細(xì)胞

8、減少而類軟骨樣細(xì)胞分布增多。各組中的上下終板染色沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論：
　　 大鼠尾椎椎間盤易于顯露，操作方便，是建立椎間盤退變動(dòng)物模型的一個(gè)較好選擇。采用21 G穿刺針進(jìn)行纖維環(huán)穿刺的方法在術(shù)后2周可以引起明確的椎間盤退變改變。
　　 第二部分：大鼠正常與退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛的對(duì)比及其機(jī)制研究
　　 研究背景：
　　 腰椎間盤退變及其繼發(fā)的系列病理改變是引起患者腰腿痛的主要原

9、因。椎間盤退變方面的基礎(chǔ)研究是脊柱外科領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)，如探討退變的病理生理機(jī)制、以修復(fù)或再生退變椎間盤為目的的各種生物治療等近年來得到了廣泛研究。從臨床角度出發(fā)，深入研究腰腿痛的發(fā)生機(jī)制與椎間盤退變之間的聯(lián)系具有十分重要的意義。對(duì)椎間盤退變各種動(dòng)物模型的建立以及生物治療方法的驗(yàn)證等只有考慮到與疼痛相聯(lián)系時(shí)才更具實(shí)際意義。
　　 鑒于人類感知疼痛的復(fù)雜性與主觀性，決定了很難利用動(dòng)物模型來精確模擬和評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)腰痛這樣的軸性痛，因此目前

10、在疼痛方面的研究多利用了實(shí)驗(yàn)性椎間盤髓核突出或其他機(jī)械因素壓迫引起的神經(jīng)根性疼痛模型來代替，以模擬臨床上最常見的腰椎間盤退變性疾病——腰椎間盤突出癥的發(fā)生。近年來大量研究表明：除機(jī)械壓迫因素外，與椎間盤髓核有關(guān)的炎性化學(xué)因子所造成的刺激，是引起神經(jīng)功能受損害或產(chǎn)生疼痛的重要原因。但既往這些研究都是直接利用自體或者是異體的髓核組織進(jìn)行移植，而在臨床上，絕大部分腰椎間盤突出癥的患者都伴有明顯的退變改變，表現(xiàn)為MRI上信號(hào)降低或“黑盤征”。已

11、發(fā)生退變的椎間盤組織與正常的椎間盤無論是在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化成分還是在多種細(xì)胞因子含量等方面都有明顯差異，因此，有必要利用退變性髓核突出導(dǎo)致神經(jīng)根性疼痛的模型來研究椎間盤退變與疼痛之間的關(guān)系并進(jìn)行機(jī)制方面的探討。
　　 目的：
　　 探討大鼠正常與退變性髓核突出誘致神經(jīng)根性疼痛的不同，研究椎間盤退變與神經(jīng)根性疼痛之間的關(guān)系；探討腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及其受體(TNFR1及TNFR2)在疼痛進(jìn)展過程中的作用。
　

12、　 方法：
　　 利用尾椎椎間盤纖維環(huán)穿刺的方法建立椎間盤退變模型后，分別取出自體的退變髓核與正常髓核組織，置于手術(shù)顯露后的腰5左側(cè)神經(jīng)根處，建立髓核突出導(dǎo)致神經(jīng)根性疼痛模型。分別在術(shù)后1，4，7，10，14和21天采用行為學(xué)測(cè)試的方法檢測(cè)兩組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、機(jī)械刺激閾值與熱刺激閾值；分別在術(shù)后第4與14天采用免疫組化的方法檢測(cè)兩組的腰5左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α的表達(dá)。在退變性髓核突出導(dǎo)致神經(jīng)根疼痛模型后，分別在術(shù)后1，4，

13、7，10，14和21天采用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)中TNFR1和TNFR2的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 所有4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)前后均沒有出現(xiàn)跛行、步態(tài)異常或癱瘓的現(xiàn)象，運(yùn)動(dòng)損害功能評(píng)分為0分。對(duì)照組和假手術(shù)組動(dòng)物沒有出現(xiàn)明顯的機(jī)械痛覺過敏現(xiàn)象；而無論是正常還是退變髓核移植組大鼠都出現(xiàn)了手術(shù)側(cè)(同側(cè))后肢的機(jī)械刺激閾值明顯降低-逐漸恢復(fù)的一個(gè)過程，且痛覺過敏的現(xiàn)象一直持續(xù)到術(shù)后第10～14天

14、之間結(jié)束。同時(shí)，通過對(duì)術(shù)后某一時(shí)間點(diǎn)的組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在手術(shù)后的第1、4、7天，移植退變髓核的N-NP組大鼠機(jī)械性閾值比P-NP組更低(P值分別為0.038，0.021和0.038，均＜0.05)，表明該組的機(jī)械性痛覺過敏程度更重。手術(shù)對(duì)側(cè)盡管在特定的時(shí)間點(diǎn)也有疼痛過敏的發(fā)生，沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的變化過程。與機(jī)械性刺激的結(jié)果不同，術(shù)后的熱刺激閾值沒有呈現(xiàn)規(guī)律性變化。與手術(shù)前相比，在手術(shù)側(cè)僅有下列時(shí)間點(diǎn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：P-NP組：手術(shù)后1天(P

15、=0.017)；N-NP組：手術(shù)后第4天(P=0.025)與第10天(P=0.042)。手術(shù)對(duì)側(cè)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的閡值降低。對(duì)照組和假手術(shù)組切片陽性染色很少。相比之下，兩種髓核移植組在術(shù)后第4及14天都觀察到了DRG中TNF-α表達(dá)量的顯著升高，強(qiáng)陽性染色主要位于神經(jīng)元胞漿，分布比較均勻；間質(zhì)細(xì)胞也有部分陽性表現(xiàn)。計(jì)數(shù)切片顯微鏡視野內(nèi)陽性染色細(xì)胞的數(shù)目并做比較發(fā)現(xiàn)，N-NP組與P-NP組之間相比，陽性細(xì)胞數(shù)目在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異

16、(第4天P=0.252，第14天P=0.146)。對(duì)退變性髓核移植組DRG中兩種TNFR蛋白的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，TNFR-1在術(shù)后早中期持續(xù)維持在較高水平(10 d內(nèi))，與疼痛過敏進(jìn)程相關(guān)；而TNFR-2除在術(shù)后的早期(1 d)有高表達(dá)外，還在痛覺過敏恢復(fù)后(14 d、21 d)有高表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠自體尾椎椎間盤髓核移植到腰5神經(jīng)根可以引起明顯的機(jī)械性痛覺過敏現(xiàn)象發(fā)生。
　　 2.與正常髓核組織相