禽痘病毒對(duì)雛雞皮膚病變的演化及MAPKs通路研究.pdf

1、禽痘是由禽痘病毒(Avian poxvirus，APVs)引起的各個(gè)年齡段家禽、鳥(niǎo)類(lèi)發(fā)病以出痘為主要特征的一種傳染性疾病。病毒感染后能夠?qū)е滤拗鞯乃劳觯瑫r(shí)容易繼發(fā)感染，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶了極大地經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)野生鳥(niǎo)類(lèi)，尤其是瀕危鳥(niǎo)類(lèi)造成極大威脅。本研究通過(guò)建立APVs感染雞動(dòng)物模型，運(yùn)用病理學(xué)方法，比較了雞源和野生山斑鳩源APVs的致病性，觀察了痘疹的發(fā)生發(fā)展過(guò)程;利用熒光定量PCR技術(shù)，測(cè)定了感染雞皮膚組織相關(guān)因子的表達(dá)量，試圖探索A

2、PVs致皮膚組織增生的機(jī)制。
　　1.APV-P4b多克隆抗體的制備
　　本實(shí)驗(yàn)以APVs的DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增P4b基因，克隆至pET42b載體上，經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序分析正確后，獲得重組質(zhì)粒pET42b-APV-P4b，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中，在IPTG終濃度0.1mmol/L和37℃條件下誘導(dǎo)6h，外源基因獲得高效表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA對(duì)蛋白進(jìn)行純化，純化后的APV-P4b蛋白

3、免疫家兔，經(jīng)三次免疫后選擇血清效價(jià)最高的兔子，取全血，分離得到APV-P4b多克隆抗體，經(jīng)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，結(jié)果表明多克隆抗體可特異性識(shí)別APVs。
　　2.雛雞感染模型的建立
　　用來(lái)源于雞和野生山斑鳩的APVs，分別命名為HN-1210毒株和HN-1308毒株，分別感染10日齡白來(lái)航蛋雞，在感染后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h剖殺取皮膚組織，通過(guò)組織病理學(xué)觀察APVs感染皮膚后痘疹的發(fā)生發(fā)展

4、過(guò)程及APVs在皮膚組織中的分布;利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)APVs感染后皮膚組織中EGFR、Raf和CyclinD1表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，探討APVs引起皮膚上皮細(xì)胞增生的機(jī)制。
　　臨床癥狀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HN-1210毒株感染后2d出現(xiàn)少量白色痘疹，感染3d后痘疹數(shù)量明顯增多，感染5d后痘疹出現(xiàn)破潰的現(xiàn)象，形成痘痂同時(shí)伴有出血，感染后7d發(fā)生痘痂脫落。HN-1308毒株感染后5d在接種部位出現(xiàn)少量暗紅色的痘疹，感染后7d未發(fā)現(xiàn)病變有進(jìn)

5、一步加重的現(xiàn)象。組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)，HN-1210感染后2d毛囊和表皮層的上皮細(xì)胞增生，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，感染后3d毛囊上皮細(xì)胞出現(xiàn)水泡變性，在細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到有嗜酸性包涵體的存在，而表皮層無(wú)水泡變性及嗜酸性包涵體出現(xiàn)，感染5d后，表皮層上皮細(xì)胞出現(xiàn)水泡變性及細(xì)胞質(zhì)中觀察到嗜酸性包涵體，同時(shí)一些區(qū)域的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的完整性破壞，伴有明顯的出血現(xiàn)象，感染7d后表皮層與真皮層脫離，同時(shí)伴有大面積的出血。HN-1308毒株感染5d和7d后，在真

6、皮層以毛囊為中心有大量的淋巴細(xì)胞增生，伴隨有毛囊炎的發(fā)生，毛囊結(jié)構(gòu)完全消失，被嗜伊紅性均質(zhì)物所取代，表皮層組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)有增生現(xiàn)象。用免疫組織化學(xué)定位病毒抗原，結(jié)果顯示:陽(yáng)性信號(hào)存在于毛囊和上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，提示APVs感染后主要存在于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
　　熒光定量檢測(cè)皮膚中EGFR介導(dǎo)的增生信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)量，結(jié)果顯示HN-1210毒株感染后EGFR的表達(dá)量在1d到5d處于上調(diào)狀態(tài)，感染后3d達(dá)到最高值;Raf表達(dá)